Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM. Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert. Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen. Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert. Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert. Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden. Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt. Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht. Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. / Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost. However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time. In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data. I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them. I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units. The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model. I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples. I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities. Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems. I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging.

Die Fernerkundung war in den vergangenen Jahren von einschneidenden Umbrüchen gekennzeichnet, die sich besonders in der stark gestiegenen geometrischen Bodenauflösung der Sensoren und den damit einhergehenden Veränderungen der Verarbeitungs- und Auswertungsverfahren widerspiegeln. Sehr hoch auflösende Satellitenbilddaten - definiert durch eine Auflösung zwischen einem halben und einem Meter - existieren seit dem Start von IKONOS Ende 1999. Etwa im selben Zeitraum wurden extrem hoch auflösende digitale Flugzeugkameras (0,1 bis 0,5 m) entwickelt. Dieser Arbeit liegen IKONOS-Daten mit einer Auflösung von einem (panchromatischer Kanal) bzw. vier Metern (Multispektraldaten) zugrunde. Bedingt durch die Eigenschaften sehr hoch aufgelöster Bilddaten (z. B. Detailgehalt, starke spektrale Variabilität, Datenmenge) lassen sich bisher verfügbare Standardverfahren der Bildverarbeitung nur eingeschränkt anwenden. Die Ergebnisse der in dieser Arbeit getesteten Verfahren verdeutlichen, dass die Methoden- bzw. Softwareentwicklung mit den technischen Neuerungen nicht Schritt halten konnte. Einige Verfahren werden erst allmählich für sehr hoch auflösende Daten nutzbar (z. B. atmosphärisch-topographische Korrektur). Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Daten dieses Auflösungsbereiches mit bisher verwendeten pixelbasierten, statistischen Klassifikationsverfahren nur unzulänglich ausgewertet werden können. Die hier untersuchte Anwendung von Bildsegmentierungsmethoden hilft, die Nachteile pixelbasierter Verfahren zu überwinden. Dies wurde durch einen Vergleich pixel- und segmentbasierter Klassifikationsverfahren belegt. Im Rahmen einer Segmentierung werden homogene Bildbereiche zu Regionen verschmolzen, welche die Grundlage für die anschließende Klassifikation bilden. Hierzu stehen über die spektralen Eigenschaften hinaus Form-, Textur- und Kontextmerkmale zur Verfügung. In der verwendeten Software eCognition lassen sich diese Klassifikationsmerkmale zudem auf Grundlage des fuzzy-logic-Konzeptes in einer Wissensbasis (Entscheidungsbaum) umsetzen. Ein Vergleich verschiedener, derzeit verfügbarer Segmentierungsverfahren zeigt darüber hinaus, dass sich mit der genutzten Software eine hohe Segmentierungsqualität erzielen lässt. Der wachsende Bedarf an aktuellen Geobasisdaten stellt für sehr hoch auflösende Fernerkundungsdaten eine wichtige Einsatzmöglichkeit dar. Durch eine gezielte Klassifikation der Bilddaten lassen sich Arbeitsgrundlagen für die hier betrachteten Anwendungsfelder Landschaftsplanung und Landschaftsökologie schaffen. Die dargestellten Beispiele von Landschaftsanalysen durch die segmentbasierte Auswertung von IKONOS-Daten zeigen, dass sich eine Klassifikationsgüte von 90 % und höher erreichen lässt. Zudem können die infolge der Segmentierung abgegrenzten Landschaftseinheiten eine Grundlage für die Berechnung von Landschaftsstrukturmaßen bilden. Nationale Naturschutzziele sowie internationale Vereinbarungen zwingen darüber hinaus zur kontinuierlichen Erfassung des Landschaftsinventars und dessen Veränderungen. Fernerkundungsdaten können in diesem Bereich zur Etablierung automatisierter und operationell einsatzfähiger Verfahren beitragen. Das Beispiel Biotop- und Landnutzungskartierung zeigt, dass eine Erfassung von Landnutzungseinheiten mit hoher Qualität möglich ist. Bedingt durch das Auswertungsverfahren sowie die Dateneigenschaften entspricht die Güte der Ergebnisse noch nicht vollständig den Ansprüchen der Anwender, insbesondere hinsichtlich der erreichbaren Klassifikationstiefe. Die Qualität der Ergebnisse lässt sich durch die Nutzung von Zusatzdaten (z. B. GIS-Daten, Objekthöhenmodelle) künftig weiter steigern. Insgesamt verdeutlicht die Arbeit den Trend zur sehr hoch auflösenden digitalen Erderkundung. Für eine breite Nutzung dieser Datenquellen ist die weitere Entwicklung automatisierter und operationell anwendbarer Verarbeitungs- und Analysemethoden unerlässlich. / In recent years remote sensing has been characterised by dramatic changes. This is reflected especially by the highly increased geometrical resolution of imaging sensors and as a consequence thereof by the developments in processing and analysis methods. Very high resolution satellite imagery (VHR) - defined by a resolution between 0.5 and 1 m - exists since the start of IKONOS at the end of 1999. At about the same time extreme high resolution digital airborne sensors (0.1 till 0.5 m) have been developed. The basis of investigation for this dissertation is IKONOS imagery with a resolution of one meter (panchromatic) respectively four meters (multispectral). Due to the characteristics of such high resolution data (e.g. level of detail, high spectral variability, amount of data) the use of previously available standard methods of image processing is limited. The results of the procedures tested within this work demonstrate that the development of methods and software was not able to keep up with the technical innovations. Some procedures are only gradually becoming suitable for VHR data (e.g. atmospheric-topographic correction). Additionally, this work shows that VHR imagery can be analysed only inadequately using traditional pixel-based statistical classifiers. The herein researched application of image segmentation methods helps to overcome drawbacks of pixel-wise procedures. This is demonstrated by a comparison of pixel and segment-based classification. Within a segmentaion, homogeneous image areas are merged into regions which are the basis for the subsequent classification. For this purpose, in addition to spectral features also formal, textural and contextual properties are available. Furthermore, the applied software eCognition allows the definition of the features for classification based on fuzzy logic in a knowledge base (decision tree). An evaluation of different, currently available segmentation approaches illustrates that a high segmentation quality is achievable with the used software. The increasing demand for geospatial base data offers an important field of application for VHR remote sensing data. With a targeted classification of the imagery the creation of working bases for the herein considered usage for landscape planning and landscape ecology is possible. The given examples of landscape analyses using a segment-based processsing of IKONOS data show an achievable classification accuracy of 90 % and more. The landscape units delineated by image segmentation could be used for the calculation of landscape metrics. National aims of nature conservation as well as international agreements constrain a continuous survey of the landscape inventory and the monitoring of its changes. Remote sensing imagery can support the establishment of automated and operational methods in this field. The example of biotope and land use type mapping illustrates the possibility to detect land use units with a high precision. Depending on the analysis method and the data characteristics the quality of the results is not fully equivalent to the user?s demands at the moment, especially concerning the achievable depth of classification. The quality of the results can be enhanced by using additional thematic data (e.g. GIS data, object elevation models). To summarize this dissertation underlines the trend towards very high resolution digital earth observation. Thus, for a wide use of this kind of data it is essentially to further develop automated and operationally useable processing and analysis methods.

Die Fernerkundung war in den vergangenen Jahren von einschneidenden Umbrüchen gekennzeichnet, die sich besonders in der stark gestiegenen geometrischen Bodenauflösung der Sensoren und den damit einhergehenden Veränderungen der Verarbeitungs- und Auswertungsverfahren widerspiegeln. Sehr hoch auflösende Satellitenbilddaten - definiert durch eine Auflösung zwischen einem halben und einem Meter - existieren seit dem Start von IKONOS Ende 1999. Etwa im selben Zeitraum wurden extrem hoch auflösende digitale Flugzeugkameras (0,1 bis 0,5 m) entwickelt. Dieser Arbeit liegen IKONOS-Daten mit einer Auflösung von einem (panchromatischer Kanal) bzw. vier Metern (Multispektraldaten) zugrunde. Bedingt durch die Eigenschaften sehr hoch aufgelöster Bilddaten (z. B. Detailgehalt, starke spektrale Variabilität, Datenmenge) lassen sich bisher verfügbare Standardverfahren der Bildverarbeitung nur eingeschränkt anwenden. Die Ergebnisse der in dieser Arbeit getesteten Verfahren verdeutlichen, dass die Methoden- bzw. Softwareentwicklung mit den technischen Neuerungen nicht Schritt halten konnte. Einige Verfahren werden erst allmählich für sehr hoch auflösende Daten nutzbar (z. B. atmosphärisch-topographische Korrektur). Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Daten dieses Auflösungsbereiches mit bisher verwendeten pixelbasierten, statistischen Klassifikationsverfahren nur unzulänglich ausgewertet werden können. Die hier untersuchte Anwendung von Bildsegmentierungsmethoden hilft, die Nachteile pixelbasierter Verfahren zu überwinden. Dies wurde durch einen Vergleich pixel- und segmentbasierter Klassifikationsverfahren belegt. Im Rahmen einer Segmentierung werden homogene Bildbereiche zu Regionen verschmolzen, welche die Grundlage für die anschließende Klassifikation bilden. Hierzu stehen über die spektralen Eigenschaften hinaus Form-, Textur- und Kontextmerkmale zur Verfügung. In der verwendeten Software eCognition lassen sich diese Klassifikationsmerkmale zudem auf Grundlage des fuzzy-logic-Konzeptes in einer Wissensbasis (Entscheidungsbaum) umsetzen. Ein Vergleich verschiedener, derzeit verfügbarer Segmentierungsverfahren zeigt darüber hinaus, dass sich mit der genutzten Software eine hohe Segmentierungsqualität erzielen lässt. Der wachsende Bedarf an aktuellen Geobasisdaten stellt für sehr hoch auflösende Fernerkundungsdaten eine wichtige Einsatzmöglichkeit dar. Durch eine gezielte Klassifikation der Bilddaten lassen sich Arbeitsgrundlagen für die hier betrachteten Anwendungsfelder Landschaftsplanung und Landschaftsökologie schaffen. Die dargestellten Beispiele von Landschaftsanalysen durch die segmentbasierte Auswertung von IKONOS-Daten zeigen, dass sich eine Klassifikationsgüte von 90 % und höher erreichen lässt. Zudem können die infolge der Segmentierung abgegrenzten Landschaftseinheiten eine Grundlage für die Berechnung von Landschaftsstrukturmaßen bilden. Nationale Naturschutzziele sowie internationale Vereinbarungen zwingen darüber hinaus zur kontinuierlichen Erfassung des Landschaftsinventars und dessen Veränderungen. Fernerkundungsdaten können in diesem Bereich zur Etablierung automatisierter und operationell einsatzfähiger Verfahren beitragen. Das Beispiel Biotop- und Landnutzungskartierung zeigt, dass eine Erfassung von Landnutzungseinheiten mit hoher Qualität möglich ist. Bedingt durch das Auswertungsverfahren sowie die Dateneigenschaften entspricht die Güte der Ergebnisse noch nicht vollständig den Ansprüchen der Anwender, insbesondere hinsichtlich der erreichbaren Klassifikationstiefe. Die Qualität der Ergebnisse lässt sich durch die Nutzung von Zusatzdaten (z. B. GIS-Daten, Objekthöhenmodelle) künftig weiter steigern. Insgesamt verdeutlicht die Arbeit den Trend zur sehr hoch auflösenden digitalen Erderkundung. Für eine breite Nutzung dieser Datenquellen ist die weitere Entwicklung automatisierter und operationell anwendbarer Verarbeitungs- und Analysemethoden unerlässlich. / In recent years remote sensing has been characterised by dramatic changes. This is reflected especially by the highly increased geometrical resolution of imaging sensors and as a consequence thereof by the developments in processing and analysis methods. Very high resolution satellite imagery (VHR) - defined by a resolution between 0.5 and 1 m - exists since the start of IKONOS at the end of 1999. At about the same time extreme high resolution digital airborne sensors (0.1 till 0.5 m) have been developed. The basis of investigation for this dissertation is IKONOS imagery with a resolution of one meter (panchromatic) respectively four meters (multispectral). Due to the characteristics of such high resolution data (e.g. level of detail, high spectral variability, amount of data) the use of previously available standard methods of image processing is limited. The results of the procedures tested within this work demonstrate that the development of methods and software was not able to keep up with the technical innovations. Some procedures are only gradually becoming suitable for VHR data (e.g. atmospheric-topographic correction). Additionally, this work shows that VHR imagery can be analysed only inadequately using traditional pixel-based statistical classifiers. The herein researched application of image segmentation methods helps to overcome drawbacks of pixel-wise procedures. This is demonstrated by a comparison of pixel and segment-based classification. Within a segmentaion, homogeneous image areas are merged into regions which are the basis for the subsequent classification. For this purpose, in addition to spectral features also formal, textural and contextual properties are available. Furthermore, the applied software eCognition allows the definition of the features for classification based on fuzzy logic in a knowledge base (decision tree). An evaluation of different, currently available segmentation approaches illustrates that a high segmentation quality is achievable with the used software. The increasing demand for geospatial base data offers an important field of application for VHR remote sensing data. With a targeted classification of the imagery the creation of working bases for the herein considered usage for landscape planning and landscape ecology is possible. The given examples of landscape analyses using a segment-based processsing of IKONOS data show an achievable classification accuracy of 90 % and more. The landscape units delineated by image segmentation could be used for the calculation of landscape metrics. National aims of nature conservation as well as international agreements constrain a continuous survey of the landscape inventory and the monitoring of its changes. Remote sensing imagery can support the establishment of automated and operational methods in this field. The example of biotope and land use type mapping illustrates the possibility to detect land use units with a high precision. Depending on the analysis method and the data characteristics the quality of the results is not fully equivalent to the user?s demands at the moment, especially concerning the achievable depth of classification. The quality of the results can be enhanced by using additional thematic data (e.g. GIS data, object elevation models). To summarize this dissertation underlines the trend towards very high resolution digital earth observation. Thus, for a wide use of this kind of data it is essentially to further develop automated and operationally useable processing and analysis methods.