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Previous issue date: 2014-02-27 / The present situation of energy and environmental setting in the world has favored the development of alternative energy sources, and has emerged as an option the use of biofuels, such as bioethanol. Besides ethanol produced from sugarcane, there is the alternative of to use plant biomass to get called second-generation ethanol. In Brazil, the major lignocellulosic material used to produce bioethanol is sugarcane bagasse, and this ethanol is obtained by fermentation of the hydrolyzate of the plant cell wall polysaccharides, this hydrolysis is performed normally by enzymes cellulolytic. Microorganisms, such as fungi of the genus Trichoderma, which are filamentous fungi present in the soil, have a variety of these enzymes that convert cellulose into glucose. In this context, the aim of this study was the recombinant production of Trichoderma harzianum IOC-3844 endoglucanase IV and its biochemical characterization. This Endo IV, which presents high similarity with Endo IV of other Thichoderma species, was expressed using the heterologous expression system of the yeast Pichia pastoris, and after be purified, assays were performed to test their activity. The recombinant enzyme hasn t show sign of degradation in any of the substrates used and can t be confirmed its hydrolytic action. However, the literature has been showed that these enzymes have capacity to increase the breaking of lignocellulose by cellulases (or a mix of them). Based on these data, a test was performed to evaluate the ability of endo IV supplemental activity in the cocktail Acellerase 1500 (Genencor) in the hydrolysis of biomass. In the experiment, copper was added as an electron donor and despite the increase in the hydrolysis of sugarcane bagasse the results showed that copper alone improves the cocktail performance. A circular dichroism analysis was performed and showed that the recombinant Endo IV is correctly coiled. The study showed that the enzyme produced at the laboratory has a high level of expression, but its activity couldn t be detected. The intention now is to perform tests with cocktails that don t contain expansins and isolated enzymes in order to verify that the Endo IV has effect upon them. / A atual situação do cenário energético e ambiental do mundo tem favorecido o desenvolvimento de fontes alternativas de energia, e como opção tem surgido a utilização de biocombustíveis, como o bioetanol. Além do etanol produzido a partir do caldo de cana, há a alternativa de utilizar a biomassa vegetal para obter o chamado etanol de segunda geração. No Brasil o principal material lignocelulósico utilizado para produção de bioetanol é o bagaço de cana-de-açúcar, e este etanol é obtido por meio da fermentação do hidrolisado dos polissacarídeos da parede celular dos vegetais, sendo esta hidrólise, realizada, normalmente, por enzimas celulolíticas. Microrganismos, como os fungos do gênero Trichoderma, que são fungos filamentosos presentes no solo, possuem uma variedade dessas enzimas capazes de converter a celulose em glicose. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção recombinante da enzima endoglucanase IV de Trichoderma harzianum IOC-3844 e sua caracterização bioquímica. Esta Endo IV, que apresenta alta similaridade com as Endo IV de outras espécies de Thichoderma, foi expressa utilizando-se o sistema de expressão heteróloga da levedura Pichia pastoris e, após ser purificada, foram realizados ensaios para testar sua atividade. A enzima recombinante não demonstrou sinal de degradação em nenhum dos substratos utilizados, não podendo ser comprovada sua ação hidrolítica. Porém, na literatura consta que essas enzimas têm a capacidade de aumentar a quebra de lignocelulose por celulases (ou uma mistura delas). Com base nesses dados, um teste foi realizado para avaliar a capacidade da endo IV de suplementar a atividade do coquetel Acellerase 1500 (Genencor) na hidrólise de biomassa. No experimento, foi adicionado cobre como doador de elétrons e apesar do aumento na hidrólise do bagaço-de-cana os resultados mostraram que o cobre sozinho melhora a performance do coquetel. Uma análise de dicroísmo circular foi realizada e revelou que a Endo IV recombinante se encontra corretamente enovelada. O estudo mostrou que a enzima produzida em laboratório possui alto nível de expressão, porém sua atividade não pôde ser constatada. Pretende-se agora realizar testes com coquetéis que não contêm expansinas e com enzimas isoladas, a fim de verificar se a Endo IV possui efeito sobre elas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5543 |
| Date | 27 February 2014 |
| Creators | Corrêa, Rafaela Francini |
| Contributors | Silva, Flávio Henrique da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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