Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa
de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado
que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La
región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por
la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por
CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer
de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza
a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”.
El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c
en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en
el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se
plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila
a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal;
2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c
en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía
ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal.
Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene
tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a
este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la
región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que
CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados
al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando
que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la
fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento
con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1.
La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1
total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición
de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-
1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó
los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de
ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron
ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que
la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal
de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de
colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y
no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron
tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos
funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de
transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial
migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión
de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar
la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos
resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta
la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión
de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo
por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora
enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease
involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in
invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region
of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we
studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion
in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein
kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness
of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether
CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability
and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal
cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were
considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal
region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether
CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal
cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion
of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation.
An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three
putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this
background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive
ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing
that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing
phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the
phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation
occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation
assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1
phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark.
Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition
in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition
using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1
and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally,
assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed
that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region
of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this
context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2
expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability,
respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion
using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing
the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable
by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive
capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion
is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting
enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal
end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes
malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/142454 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Niechi Gaete, Ignacio Alfredo |
| Contributors | Tapia Pineda, Julio |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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