Paracoccidioides brasiliensis é o agente da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença sistêmica crônica prevalente na América Latina. Até o momento, não existe uma vacina eficaz para esta enfermidade. O potencial da radiação gama para a atenuação de patógenos e desenvolvimento de uma vacina foi explorado neste trabalho. Em nosso laboratório
desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Estas perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram a sua morfologia, a síntese e secreção de
proteínas, o metabolismo oxidativo e o seu perfil antigênico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora induzida pela imunização com as leveduras radioatenuadas
em modelo animal. A atenuação da virulência das leveduras radioatenuadas foi avaliada em camundongos BALB/c e Nude-Nude. O efeito protetor foi avaliado em grupos de
camundongos BALB/c submetidos a uma ou duas imunizações. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, que foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os camundongos foram sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. Os órgãos removidos foram usados para recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs), análise histológica e
determinação de citocinas. Os soros foram coletados semanalmente para avaliar os títulos de IgG e o padrão de IgG1 e IgG2a produzido no curso da infecção. Para avaliar o tipo de resposta imune desencadeada, as citocinas IFN-g, TNF-a, IL-10 e IL-5 foram determinadas por PCR em tempo real. As leveduras radioatenuadas perderam a sua virulência, pois não foram capazes de provocar infecção em camundongos BALB/c e Nu/Nu. Nenhuma UFC foi recuperada nem foram observadas alterações histopatológicas nos camundongos infectados com o fungo radioatenuado. Os camundongos infectados com P. brasiliensis não
irradiado mostraram altos níveis de produção do anticorpo IgG, enquanto a infecção com as leveduras radioatenuadas não estimulou alterações significativas destes níveis. Os
camundongos infectados com a levedura radioatenuada apresentaram um aumento na produção de IFN-g e TNF-a, indicando uma estimulação da imunidade celular. O ensaio de
proteção realizado com camundongos imunizados uma vez mostrou uma redução significativa na recuperação das UFCs avaliadas 30 dias após o desafio. Entretanto, foi
verificado um aumento na recuperação das UFCs dos tecidos 90 dias após o desafio.
Apesar de um grau significativo de proteção ter sido alcançado, estes resultados mostram que somente uma imunização não foi suficiente para conferir uma proteção a longo prazo, uma vez que alguns focos do fungo não foram eliminados. Uma proteção eficiente foi desenvolvida no grupo dos camundongos imunizados duas vezes. A imunização foi capaz de reduzir a infecção inicial e desencadear uma proteção a longo prazo. Uma proteção de 99,5% foi obtida nos camundongos analisados 90 dias após desafio. Neste mesmo período os níveis de IFN-g e TNF-a aumentaram significativamente, enquanto os de IL-10 e IL-5
diminuíram. Quando analisados 30 dias após o desafio os camundongos não desenvolveram um padrão totalmente polarizado de resposta Th1/Th2, mas uma tendência para um padrão Th1 foi evidente após 90 dias. Os níveis de IgG aumentaram em ambos os grupos após o desafio. Concluímos que a imunização com as leveduras radioatenuadas foi capaz de desencadear uma resposta imune protetora a longo prazo. Estas células são uma ferramenta valiosa em estudos da imunidade protetora e na pesquisa de vacina para a PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is fungus agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic systemic disease prevalent in Latin American. To date, there is no effective vaccine. The potential of gamma radiation for pathogens attenuation and vaccine development was explored in this work. In our laboratory were developed yeast cells of P. brasiliensis attenuated by gamma radiation, which lose the reproductive ability, while retaining the morphology, the synthesis and secretion of proteins, the oxidative metabolism and the expression of the antigens present in the native yeast. The aim of the present work was to evaluate the protection elicited by the immunization with this cells in animal model. The virulence attenuated was evaluated in BALB/c and Nude-Nude mice. The protector effect was evaluated in BALB/c mice groups immunized once or twice. Each group was divided in three sub groups that were challenge 30, 45 or 60 days after the immunization. The mice were sacrificed 30 and 90 days after challenge. The removed organs were used for colonyforming units (CFUs) recover, histopathological analysis and cytokine determination. The sera were collected weekly to evaluate the IgG antibody titers and the IgG1 and IgG2a
pattern in the course of infection. To evaluate the type of elicited immune response the cytokines IFN-g, TNF-a, IL-10 and IL-5 were determined by real time PCR. The radioattenuated yeast loses its virulence since fails in producing infection in BALB/c and Nude-Nude mice. No CFUs were recovered neither histological changes observed in the
mice infected with the radioattenuated cells. The mice infected with the not irradiated P. brasiliensis showed a high level of antibody production while the infection with the
radioattenuated yeast did not significantly change the antibody level. The mice infected with the radioattenuated yeast presented an increase in the IFN-g and TNF-a production and an inhibition of the IL-10 synthesis, indicating a stimulation of the cellular response. The protection assay performed with mice immunized once showed a significant reduction in the CFUs recovery evaluated 30 days after the challenge. However, when examined 90 days after the challenge the CFUs recovered from organs increased. Even so a significant degree of protection has been reached these results point that only one immunization was not enough to confer a long lasting protection, since some focus of the fungi were not eliminated. An efficient protection against highly infective forms of P. brasiliensis was developed in the mice group immunized twice. The immunization was able to reduce the initial infection and elicited a long lasting protection. A 99,5 % protection was obtained in the mice analyzed 90 days post challenge. At the same time the levels of IFN-gDQG71).
increased significantly while the IL-10 and IL-5 decreased. When analyzed after 30 days, the mice had not developed a totally polarized pattern of Th1/Th2 response but, a trend to a
Th1 response was evident after 90 days. The level of IgG increased in both immunized groups after the challenge. We concluded that the immunization with the radioattenuated
yeast cells was able to elicit a long lasting protective immune response and these cells are valuable tool for protective immunity studies and vaccine research for PCM.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.cdtn.br:39 |
| Date | 06 July 2007 |
| Creators | Estefânia Mara do Nascimento Martins |
| Contributors | Antero Silva Ribeiro de Andrade, Alfredo Miranda Goes, Carlos Alberto Pereira Tavares, Maria Aparecida de Resende, Suely Epsztein Grynberg |
| Publisher | CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, CTRA - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, CDTN, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do CDTN, instname:Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, instacron:CDTN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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