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Previous issue date: 2018-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The release of transgenic cultivars of recalcitrant species such as cotton can be delayed due to the difficulty in regenerating the transformed tissue. Existing regeneration protocols are limited to a few responsive varieties, such as Coker, commonly used as recipients during genetic transformation. One of the factors that may be related to recalcitrance is the inefficiency in the activation of different genes during in vitro culture that may be associated with the acquisition of embryogenic competence. Among the genes mentioned in the literature, the Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) is shown to be responsible for the transition from the somatic cell state to the embryogenic in different plant species. The potential of this gene as a marker of somatic embryogenesis has been investigated. In this work, the relationship of the levels of GhSERK1 expression with the acquisition of embryogenic competence in cotton genotypes was analyzed. For this, a short sequence (186 bp) of this gene was selected from the conserved region between cotton and five other dicotyledons (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max and Phaseolus vulgaris) in order to allow the probe can be applied in the selection of other cultures. Initially, the RT-qPCR gene expression tests were performed in six genotypes with known embryogenic capacity (embryogenic - Coker 312, BRS Rubi and BRS Seridó and non-embryogenic - BRS 201, CNPA Precoce 1 and BRS Topázio), from RNA extracted from meristematic zygotic tissues. The aforementioned genotypes were induced to somatic embryogenesis in medium supplemented with naphthaleneacetic acid and kinetin. Corroborating with the result obtained via RT-qPCR, somatic embryos were formed only in Coker 312, BRS Seridó and BRS Rubi. In the latter, the percentage of fertile plants obtained was higher (50%) than Coker 312 (41.6%). The selective applicability of GhSERK1 was validated in four genotypes top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 and CNPA BA 2247) with unknown in vitro behavior. Simultaneously, we performed induction tests on somatic embryogenesis to verify the expression results. In the genotypes in which the relative expression was higher (Coker 312 and CNPA BA 139), somatic embryos were formed. A nonradioactive probe was then grown from the 186 bp fragment and attested for its efficiency via Southern Blot in the top line genotypes, robust spots were observed in Coker 312 and CNPA BA 139. Based on these results, the latter was selected as the recipient genotype in future transformation studies. In addition, the sequence used allowed to identify genotypes responsive to somatic embryogenesis from zygotic tissues, optimizing time and costs. This work provides collaborations for the understanding of factors that may be involved in the acquisition of embryogenic competence generating perspectives of new studies to strengthen the programs of genetic improvement of the culture. / O lançamento de cultivares transgênicas de espécies recalcitrantes como o algodoeiro pode ser retardado devido à dificuldade em regenerar o tecido transformado. Os protocolos de regeneração existentes limitam-se a poucas variedades responsivas, como a Coker, normalmente utilizadas como receptoras durante a transformação genética. Um dos fatores que podem estar ligados à recalcitrância, é a ineficiência na ativação de diferentes genes durante o cultivo in vitro que podem estar associados à aquisição de competência embriogênica. Dentre os genes citados na literatura, destaca-se o Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase (SERK) retratado como responsável pela transição do estado celular somático para embriogênico em diferentes espécies de plantas. A potencialidade deste gene como marcador de embriogênese somática tem sido investigada. Neste trabalho, foram analisadas a relação dos níveis de expressão de GhSERK1 com a aquisição de competência embriogênica em genótipos de algodoeiro. Para isto, uma sequência curta (186 pb) deste gene foi selecionada a partir de região conservada entre o algodão e cinco outras dicotiledôneas (Theobroma cacao, Citrus sinensis, Vitis vinifera, Glycine max e Phaseolus vulgaris) de modo a permitir que a sonda também possa ser aplicada na seleção de outras culturas. Inicialmente, os testes de expressão gênica via RT-qPCR foram realizados em seis genótipos com capacidade embriogênica conhecida (embriogênicos – Coker 312, BRS Rubi e BRS Seridó e não embriogênicos – BRS 201, CNPA Precoce 1 e BRS Topázio), a partir de RNA extraído de tecidos zigóticos meristemáticos. Os genótipos supracitados foram induzidos à embriogênese somática em meio suplementado com ácido naftalenoacético e kinetina. Corroborando com o resultado obtido via RT-qPCR, embriões somáticos formaram-se apenas na Coker 312, BRS Seridó e BRS Rubi. Nesta última, o percentual de plantas férteis obtidas foi maior (50%) do que o Coker 312 (41,6%). A aplicabilidade seletiva do GhSERK1 foi validada em quatro genótipos top lines (CNPA 286, CNPA BA 139, CNPA BA 1366 e CNPA BA 2247) com comportamento in vitro desconhecido. Simultaneamente, realizamos ensaios de indução à embriogênese somática para comprovar os resultados de expressão. Nos genótipos em que a expressão relativa foi maior (Coker 312 e CNPA BA 139) houve a formação de embriões somáticos. Uma sonda não radioativa foi então desenvolvida a partir do fragmento de 186 pb e atestada sua eficiência via Southern Blot nos genótipos top lines, manchas robustas foram observadas em Coker 312 e CNPA BA 139. Com base nestes resultados, este último foi selecionado como genótipo receptor em futuros estudos de transformação. Além disso, a sequência utilizada permitiu identificar os genótipos responsivos à embriogênese somática a partir de tecidos zigóticos, otimizando o tempo e os custos. Este trabalho fornece colaborações para a compreensão de fatores que podem estar envolvidos na aquisição de competência embriogênica gerando perspectivas de novos estudos para fortalecer os programas de melhoramento genético da cultura.
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/7468 |
Date | 28 June 2018 |
Creators | SOARES, Taiza da Cunha |
Contributors | MELO FILHO, Péricles de Albuquerque, SANTOS, Roseane Cavalcanti dos, CARVALHO, Julita Maria Frota Chagas de, NOGUEIRA, Rejane Jurema Mansur Custódio, LOGES, Vivian, CARVALHO FILHO, José Luiz Sandes de, CAVALCANTI, José Jaime Vasconcelos |
Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (Renorbio), UFRPE, Brasil, Rede Nordeste de Biotecnologia |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | Portuguese |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
Format | application/pdf |
Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Relation | 7794227690756777355, 600, 600, 600, 600, -8104576588452276421, 6209957791494323825, 2075167498588264571 |
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