La chromatine est connue pour son rôle dans le maintien de l'identité cellulaire. Des perturbations dans la dynamique de la chromatine sont des événements courants dans les cancers. La structure de la chromatine et sa dynamique sont fortement dépendante des protéines HP1, connues pour être impliquées dans l’extinction de l’hétérochromatine, mais également dans la régulation de l'expression des gènes, la réplication et la réparation des dommages de l'ADN. Afin de mieux caractériser les fonctions d’HP1 chez les mammifères, nous avons étudié les conséquences de l'inactivation de leurs gènes chez la souris. De façon inattendue, nous démontrons que l'inactivation d’HP1a ou d’HP1g conduit à une prédisposition élevée des souris à développer des tumeurs spécifiquement dans le foie. Par conséquent, nous avons établi des modèles murins permettant l'inactivation simultanée d’HP1a/HP1b et HP1a/HP1g spécifiquement dans les hépatocytes. Ces modèles ont montré une augmentation significative de l'incidence du développement des tumeurs dans le foie, ce qui montre que les protéines HP1 sont des suppresseurs spécifiques de tumeurs hépatiques. L'analyse histologique de foies HP1abliverKO a montré des défauts qui ressemblent à ceux observés dans une pathologie connue du foie humain, la stéatohépatite non alcoolique. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents ces fonctions des HP1, nous avons analysé le transcriptome de foies de souris âgées de 5 semaines. Ces analyses ont révélé que les gènes sur-exprimés en réponse à l’absence d’HP1ag ou HP1ab sont fortement enrichis en gènes codant pour des membres de la famille de répresseurs de transcription KRAB-ZFP. Ce résultat est intéressant car il est connu que ces répresseurs sont régulés par le corépresseur TRIM28 qui a besoin d’interagir avec HP1 pour remplir ses fonctions. Cela suggère donc une boucle d'autorégulation entre HP1, TRIM28 et KRAB-ZFP. En utilisant des souris exprimant une protéine TRIM28 qui est incapable d'interagir avec HP1 spécifiquement dans les hépatocytes, nous avons démontré que la perturbation de l'interaction entre TRIM28 et HP1 conduit au développement spontané de tumeurs dans le foie et conduit également à une surexpression des mêmes KRAB-ZFP que ceux dérégulée chez les souris HP1abliverKO et HP1agliverKO. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a mis en évidence que TRIM28 et HP1 sont recrutés de façon interdépendante dans les régions 5 'et/ou 3' des gènes de KRAB-ZFP afin de réguler leur expression. Nous avons également observé la dérégulation de certains gènes liés au cancer, comme Tert, Nox4, AR, GPC3 et Arid1a. Ces modifications sont dépendantes de l’isotope d’HP1 inactivé, ce qui reflète les différents mécanismes moléculaires de l’oncogenèse. Afin d'élucider l'impact possible d’HP1 sur l'organisation générale du noyau, j'ai effectué une analyse par immunofluorescence sur cryosections du foie. Nos données suggèrent que les caractéristiques hétérochromatiques constitutives (H3K9me3) sont remplacées par des caractéristiques hétérochromatiques facultatives (H3K27me3) en l'absence de HP1ag et que les foyers péricentriques hétérochromatiques ont une légère tendance à être délocalisés. Enfin, pour mieux comprendre les profils chromosomiques dans la tumeur du foie HP1-dépendante, nous avons effectué une hybridation génomique comparative dans les foies tumoraux. Comme prévu, plusieurs événements de gain et de perte dans les variations du nombre de copies (CNV) dans certaines régions subchromosomales ont été observés, en particulier pour les chromosomes 4, où certains membres de KRAB-ZFP sont touchés. En résumé, nos résultats montrent que les protéines HP1 sont des suppresseurs de tumeur spécifique du foie. Ces données suggèrent également que la fonction principale d’HP1 au sein du foie est de réguler l'activité de TRIM28 et ainsi réguler l'expression et l'activité de répression des KRAB-ZFP et, finalement, l'homéostasie du foie. / Chromatin is known for its essential role in establishment and maintenance of cellular identity. Accordingly, disturbances in chromatin’s dynamics are common events in cancers. Chromatin structure and dynamics is highly dependent upon HP1, small non-histone chromosomal proteins that are known to be involved in heterochromatin silencing but also in gene expression regulation, DNA replication and DNA damage repair. To better characterize HP1 functions in mammals, we have studied the consequences of the inactivation of the corresponding genes in mice. Unexpectedly, we demonstrated that inactivation of either HP1a or HP1g lead to a high predisposition of mice to develop tumors specifically within liver. Hence, we established mice models allowing simultaneous inactivation of HP1a/HP1b and HP1a/HP1g specifically within hepatocytes. These models (HP1abliverKO and HP1agliverKO) displayed a significant increased incidence of tumor development within liver, demonstrating that HP1 are liver specific tumor suppressors. Histological analysis of HP1abliverKO livers showed defects that resembled those observed in a human liver pathology known as nonalcoholic steatohepatitis (NASH) characterized by an increase of steatosis, followed by an increased inflammation and the development of fibrosis that finally leads to tumors in old animals. In the case of HP1agliverKO mice, even though inflammation and tumor development were observed, this was not linked with steatosis, strongly suggesting that the underlying mechanisms are specific of each HP1 isoform. In order to reveal molecular mechanisms, we did expression analysis in the liver of 5 weeks old mice, which revealed a strong enrichment of genes encoding for members of the KRAB-ZFP of transcriptional repressors family within genes regulated by HP1ag or HP1ab. This result is of particular interest since it is known that these repressors are regulated by the corepressor TRIM28 which has been shown to require its interaction with HP1 to fulfill its functions suggesting a loop of auto-regulation between HP1, TRIM28 and KRAB-ZFP. Using mice expressing a TRIM28 protein unable to interact with HP1 specifically within hepatocytes, we demonstrated here that the disruption of the interaction between TRIM28 and HP1 lead to spontaneous development of tumors within liver and to over-expression of the same KRAB-ZFP as those deregulated in HP1abliverKO and HP1agliverKO mice. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) pinpointed that TRIM28 and HP1 are inter-dependently recruited to the 5’ and/or 3’ ends of KRAB-ZFP genes to regulate their expression. We also observed deregulation of some cancer related genes, such as Tert (Telomerase reverse transcriptase), Nox4 (NADPH oxidase 4), AR (Androgen receptor), GPC3 (Glypican3), Arid1a (AT-Rich Interaction Domain 1A), and interestingly these alterations are depended upon the inactivated HP1 isotype, reflecting distinct molecular oncogenesis. In order to elucidate the possible impact of HP1 on global organization of the nucleus, I performed immunofluorescence analysis in the liver cryosections of 5 weeks old mice. Our data suggest that constitutive heterochromatic features (H3K9me3) are replaced by facultative heterochromatic features (H3K27me3) in absence of HP1ag and that heterochromatic pericentric foci tend to slightly be delocalized. Finally, to better understand the chromosomal rearrangements profile in HP1-dependent liver tumor, we performed Comparative genomic hybridization (CGH) in old tumoral liver. As anticipated, multiple events of gain and loss in copy number variations (CNV) in subchromosomal regions were observed, especially for chromosomes 4, where some KRAB-ZFP members are affected. Altogether, our data demonstrated that HP1 are liver-specific tumor suppressor. They also suggest that HP1 main function within liver is to regulate TRIM28 activity and thereby regulate the expression and repression activity of KRAB-ZFP and ultimately liver homeostasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016MONTT079 |
| Date | 16 September 2016 |
| Creators | Hajdari, Shefqet |
| Contributors | Montpellier, Cammas, Florence |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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