A malária é a doença infecciosa mais prevalente em regiões tropicais e subtropicais e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers do 18S rRNA (4-8 cópias/parasito) no formato semi-nested ou nested-PCR são empregadas como referência. O genoma mitocondrial dos plasmódios é pequeno (6 kb) contendo três genes que codificam a enzima citocromo c oxidase I (cox I), a citocromo c oxidase III (cox III) e a citocromo b (cyt b), com número de cópias variando de 20-150/parasito. Esta pesquisa desenvolveu uma multiplex-PCR baseada na amplificação de cox I, cox III e cytb para a detecção simultânea de Plasmodium das espécies falciparum, vivax e malariae. A utilização de três pares de primers espécie-específicos, em uma única etapa de amplificação em lugar de uma nested-PCR (18S rRNA) poderia minimizar a ocorrência de contaminações (carry-over), reduzindo o custo das reações e o tempo para a liberação de resultados. A seleção dos primers empregou a estratégia ASO (Allele Specific Oligonucleotide), os amplificados das três espécies foram clonados e os plasmídeos contendo os insertos (controles positivos) foram usados em diluições seriadas determinar o limite de detecção que foi de 22,5 cópias para P. falciparum, 28,7 cópias para P. vivax e 32 cópias para P. malariae. Como cada parasito possui entre 20-150 cópias dos genes mitocondriais, a multiplex-PCR detectou 1 parasito das três espécies. Na etapa de validação, amostras antigas e recentes provenientes de regiões endêmicas foram testadas, todas com diagnóstico de gênero e espécie de Plasmodium. A multiplex-PCR foi mais sensível que a microscopia (gota espessa) quando 104 amostras foram testadas, e tão sensível quanto a semi-nested (n=60), a nested-PCR (n=6) e a PCR em Tempo Real (n=38). No entanto, na análise das espécies de Plasmodium, houve discordâncias da multiplex-PCR tanto em relação a gota espessa, quanto com a semi-nested-PCR principalmente na detecção de infecções mistas, havendo mais espécies detectadas pela semi-nested-PCR. Não houve discordâncias com a nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Testes de especificidade da multiplex-PCR utilizando DNA de outros microrganismos e de doadores de banco de sangue não encontraram reações cruzadas (100% de especificidade). O estudo concluiu que a multiplex-PCR foi desenvolvida com sucesso, com especificidade de 100%, apresentando sensibilidade superior à gota espessa e equivalente à semi-nested-PCR, nested-PCR e PCR em Tempo Real, no entanto com discordâncias na identificação de espécies. Estudos prospectivos com amostras apresentando resultados discordantes nos testes moleculares de referência deverão ser testadas para avaliar se a nova ferramenta molecular possui sensibilidade superior. / Malaria is the most prevalent infectious disease in tropical and subtropical regions and the Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the 18S rRNA sequence (4-8 copies/parasite) in semi-nested and nested-PCR formats are the reference tests. Plasmodium mitochondrial genome is small (6 kb) containing three genes encoding cytochrome c oxidase I (cox I), cytochrome c oxidase III (cox III) and cytochrome b (cyt b), with number of copies varying from 20-150/parasite. This research developed a multiplex-PCR based on the amplification of cox I, cox III and cytb for the simultaneous detection of Plasmodium falciparum, vivax and malariae. The use of three pairs of species-specific primers in a single amplification step rather than a nested-PCR (18S rRNA) could minimize the occurrence of carry-over, reducing the cost of reactions and the time to release of results. The selection of primers employed the ASO (Allele Specific Oligonucleotide) strategy. Amplification products of the three species were cloned and the plasmids containing the inserts (positive controls) were used in serial dilutions to determine the limit of detection (LoD) of 22.5 copies for P. falciparum, 28.7 copies for P. vivax and 32 copies for P. malariae. As each parasite has between 20-150 copies of the mitochondrial genes, the multiplex-PCR was able to detect 1 parasite of the three species. In the validation stage, old and recent samples from endemic regions were tested, all with diagnosis of genus and Plasmodium species. The multiplex-PCR was more sensitive than the thick blood smear when 104 samples were tested, and was as sensitive as the semi-nested (n=60), the nested-PCR (n=6) and the Real-Time PCR (n=38). However, in relation to Plasmodium species, there were disagreements of the multiplex-PCR with respect to both, the thick blood smear and the semi-nested PCR, mainly in the detection of mixed infections, with more species detected by the semi-nested-PCR. There were no disagreements with the nested-PCR and the Real-Time PCR. Multiplex-PCR specificity tests using DNA from other microorganisms and from blood bank donors found no cross-reactivity (100% specificity). The study concluded that the multiplex-PCR was successfully developed with specificity of 100%, presenting higher sensitivity than the thick blood smear and equivalent sensitivity to the semi-nested-PCR, the nested-PCR and the real-time PCR, however with disagreements in the identification of species. Prospective studies are needed to test the multiplex-PCR on samples with discordant results in reference molecular tests to assess whether the new molecular tool has superior sensitivity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20022019-093808 |
| Date | 13 December 2018 |
| Creators | Domingues, Wilson |
| Contributors | Okay, Thelma Suely |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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