O depósito de amilina é um achado histopatológico frequente em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) e parece estar relacionado à disfunção da célula beta pancreática característica desta doença. Um estudo previamente desenvolvido em nosso laboratório verificou que oligômeros de amilina humana provocam diminuição na expressão do mRNA do gene que codifica o receptor do hormônio incretínico peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (Gipr) e aumento do índice de apoptose em ilhotas pancreáticas de rato mantidas em cultura. Considerando o importante papel do depósito amilóide e das incretinas na fisiopatologia do DM 2, os objetivos deste trabalho foram investigar (1) o efeito da amilina humana sobre a expressão dos receptores de incretinas e (2) a modulação de seu efeito tóxico por outras condições concomitantes presentes no DM, como a lipotoxicidade e os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Para isto, foi realizada a avaliação da expressão do mRNA dos genes Gipr e Glp1r (receptor do peptídeo semelhante ao glucagon) por PCR em tempo real em ilhotas expostas apenas aos oligômeros de amilina humana (10 M) por 4 e 8 h e em ilhotas expostas aos oligômeros e ao palmitato (0,5 mM) por 24 e 48 h; avaliação da expressão das proteínas GIPR e GLP1R por Western blot em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina por 12 h; e avaliação do índice de apoptose pela quantificação da atividade de caspase 3 em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina isoladamente, ou na presença de palmitato (0,5mM) por 48 h ou 5 mg/ml de albumina glicada (AlbGAD) por 72 h. A amilina não provocou alteração na expressão dos genes Gipr e Glp1r após 4 h de exposição. Após 8 e 24 h de tratamento, os oligômeros modularam negativamente a expressão destes genes. Entretanto, o tratamento das ilhotas com amilina por 48 h resultou no aumento da expressão do mRNA dos receptores de incretinas. O tratamento simultâneo com palmitato não alterou o efeito modulatório da amilina sobre a expressão dos genes Gipr e Glp1r após 24 e 48 h. A exposição das ilhotas aos oligômeros de amilina por 12 h não causou alteração na expressão das proteínas GIPR e GLP1R. A lipotoxicidade e a albumina glicada não aumentaram o efeito pró-apoptótico da amilina sobre as ilhotas pancreáticas. Em conclusão, a redução na expressão gênica dos receptores de incretinas em ilhotas pancreáticas de rato expostas aos oligômeros de amilina, que poderia indicar um mecanismo adicional pelo qual a amilina exerceria seu efeito deletério sobre células beta, diminuindo o efeito insulinotrópico induzido pelas incretinas em pacientes com DM 2, não foi constatada em relação à expressão protéica de GIPR e GLP1R no período de tempo estudado. O aumento na expressão do mRNA destes receptores provocado pela amilina após 48 horas de incubação poderia ser um mecanismo de compensação das células frente aos efeitos tóxicos dos oligômeros de amilina. O efeito próapoptótico da amilina humana sobre as células beta não parece ser potencializado pela lipotoxicidade ou por AGEs / The amyloid deposit is a common histopathological feature in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and it seems to be related to the pancreatic beta cell dysfunction characteristic of this disease. A study previously developed in our laboratory found that human amylin oligomers decrease mRNA expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (Gipr) and increase apoptosis rate in rat pancreatic islets maintained in culture. Considering the important role of the amyloid deposition and of incretins in the pathophysiology of T2DM, the aims of the present study were to investigate (1) the effect of human amylin on the expression of incretin receptors and (2) the modulation of amylin toxicity by other concomitant conditions present in T2DM, as lipotoxicity and advanced glycation end products (AGEs). The evaluation of mRNA expression of Gipr and Glp1r (glucagonlike peptide -1 receptor) was performed by real time PCR in islets exposed only to human amylin oligomers (10 M) for 4 and 8 h, and in islets exposed to human amylin and palmitate (0,5 mM) for 24 and 48 h; GIPR and GLP1R protein expression was assessed by Western blot in islets treated with amylin oligomers by 12 h; apoptosis rate was evaluated by measuring caspase 3 activity in islets treated with amylin alone or combined to palmitate (0,5 mM) for 48 h or 5 mg/mL of glycated albumin (AlbGAD) for 72 h. Amylin did not affect the expression of Gipr and Glp1r mRNA following 4 h of exposure. Eight and 24 h after treatment, amylin negatively modulated the expression of these genes. However, treatment of the islets for 48 h with amylin elicited an increase in mRNA expression of both incretin receptors. The simultaneous treatment with palmitate did not change the effects of amylin on the expression of Gipr and Glp1r mRNA after 24 and 48 h. Exposure of islets to amylin for 12 h caused no change in GIPR and GLP1R protein expression. Lipotoxocity and glycated albumin did not increase the pro-apoptotic effect of amylin on pancreatic islets. In conclusion, the reduction in mRNA expression of the incretin receptors on rat pancreatic islets exposed to amylin, which could indicate an additional mechanism whereby amylin exert its deleterious effect on beta cells, reducing the insulinotropic effects of incretins in patients with T2DM was not confirm regarding GIPR and GLP1R protein expression at the time period studied. The increased mRNA expression of these receptors caused by amylin after 48 h of incubation could be a compensation mechanism against the toxic effects of amylin oligomers. The pro-apoptotic effect of amylin on human beta cells does not appear to be potentiated by lipotoxicity or by advanced glycation end products
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07112012-105333 |
| Date | 25 July 2012 |
| Creators | Oliveira, Érika Rodrigues de |
| Contributors | Giannella, Maria Lucia Cardillo Correa |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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