Objetivo: Determinar o processo cicatricial e regenerativo da córnea em suas diferentes camadas diante do dano cirúrgico, através da Ceratectomia Fotorrefrativa (PRK) nos terços anteriores ou injúria do complexo Descemetendotélio no terço posterior. Métodos: Córneas de coelhos foram utilizadas a fim de identificar os nervos presentes, evidenciados através da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) da acetilcolinesterase (AchE) e expressos numericamente após quantificação automatizada pelo software Image-Pro. Os seguintes grupos foram incluídos nessa análise: remoção do epitélio com e sem Mitomicina (MMC) 0.02%, -9.0D PRK com e sem MMC. O dano e a regeneração dos nervos foram avaliados através da análise dos grupos após 1 dia, 1, 2, 3 e 6 meses. A morfologia e a distribuição dos nervos foram realizadas através do estudo da tubulina Beta-III, um marcador de microtúbulos presentes em neurônios. Na córnea posterior, a fim de identificar a ocorrência de apoptose após a injúria mecânica do endotélio através de uma cânula romba, cortes desse tecido foram avaliados por meio de técnicas de IHQ através do método de fragmentação do DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase (TUNEL) e microscopia de transmissão eletrônica (TEM) após 1 e 4 horas. A ocorrência de fibrose subsequente à lesão da córnea posterior foi avaliada nos grupos submetidos à Descemetorréxis ou à injúria mecânica do endotélio isolado após 1 mês. O estudo imunohistoquímico para actina de músculo liso (alfa-SMA) permitiu identificar a presença de miofibroblastos e a identificação morfológica da membrana de Descemet demonstrada através do Nidogênio-1 (Nid-1), tornando possível, portanto, a discriminação do papel das camadas posteriores no processo cicatricial da córnea. Olhos contralaterais foram incluídos como um grupo controle em todas as análises. Resultados: Na face anterior da córnea, uma menor área do complexo nervoso foi observada um dia após o PRK associado ao uso da MMC (p=0.0009) quandocomparado ao PRK sem o uso da medicação, que não se manteve após um mês (p=0.9). O PRK sem MMC demonstrou uma crescente capacidade regenerativa de seus nervos, que apresentaram valores comparáveis aos pré-operatórios após o terceiro mês. No entanto, tais fibras nervosas apresentaram uma morfologia aberrada mantida até a análise do mês seis. Na face posterior da córnea, apesar da presença de células TUNEL+ após 1 e 4 horas subsequentes ao dano mecânico do endotélio isolado, não houve a expressão de alfa-SMA no estroma posterior após um mês. A integridade estrutural da membrana de Descemet nesse grupo foi confirmada através do Nidogênio-1 (Nid-1), diferentemente do observado após o dano ao complexo Descemet-endotélio, em que houve ampla expressão de alfa-SMA identificando a presença de miofibroblastos e o consequente desenvolvimento de cicatrizes responsáveis pela perda de transparência na córnea. Conclusão: O uso do excimer laser na superfície anterior causou prejuízo à inervação da córnea. Todavia, a capacidade regenerativa das fibras nervosas foi demonstrada ao longo dos meses, apesar da persistência de uma anômala arquitetura e redistribuição dos nervos mesmo após o sexto mês. A MMC revelou uma discreta e precoce propriedade neurotóxica quando combinada ao uso do excimer laser, que não implica perda da segurança a médio/longo prazo do uso dessa droga na concentração e tempos utilizados nesse estudo. No terço posterior da córnea, a membrana de Descemet exibiu um importante papel modulador no processo de desenvolvimento de cicatrizes ou fibrose no estroma profundo. Uma vez lesada, torna constante o influxo de citocinas inflamatórias necessárias para a diferenciação e persistência do miofibroblasto. Tal processo mostrou-se análogo ao papel da membrana basal do epitélio como reguladora do processo de fibrose da córnea anterior / Purpose: To determine the wound-healing cascade and regeneration process of the cornea after surgical injury in its different layers, through Photorefractive Keratectomy (PRK) in the anterior thirds or Descemet-endothelium injury in the posterior third. Methods: Rabbit corneas were used to identify the nerves present in the central area of this tissue by the immunohistochemistry (IHQ) technique of acetylcholinesterase (AchE) and their numerical quantification by Image-Pro software. The following groups were included in this analysis: Removal of epithelium with and without Mitomycin (MMC) 0.02 %, -9.0D PRK with and without MMC. Damage and nerve regeneration were assessed by analyzing the groups after 1 day, 1, 2, 3 and 6 months. The morphology and distribution of nerves along the corneal layers was performed through tubulin beta-III study. At the posterior cornea, to distinguish the occurrence of apoptosis after the mechanical injury of the endothelium through a blunt cannula, sections of this tissue were evaluated by IHQ technique through DNA fragmentation by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase (TUNEL) and electron transmission microscopy (TEM) after 1 and 4 hours. The occurrence of cornea fibrosis subsequent to posterior corneal injury was evaluated by the group undergoing Descemet membrane surgical removal or by the endothelium mechanical injury after 1 month. The immunohistochemical study for smooth muscle actin (alpha-SMA) allowed the identification of myofibroblasts and the structural integrity of Descemet demonstrated by Nidogen-1 (Nid-1). Thus, making it possible to discriminate the role of the posterior layers during the corneal wound-healing process. Contralateral eyes were included as a control group in all analyzes. Results: At the anterior surface of the cornea, a smaller area of the nervous complex was observed one day after PRK associated with the use of MMC (p = 0.0009) when compared to PRK without the association of the drug, which was not maintained after the first month (p = 0.9). The PRK without MMC demonstrated an increasing regenerative capacity of their nerves, which presented values comparable to preoperative measurements after the third month. However, morphological differences and an aberrant distribution of innervation were persistent. At the corneal posterior surface, despite the presence of TUNEL + cells after 1 and 4 hours subsequent to the mechanical damage of the isolated endothelium, there was no alpha-SMA expression in the posterior stroma after one month. The structural integrity of Descemet\'s membrane in this group was confirmed by Nidogen-1 (Nid-1). Differently from what was observed after damage to the Descemet membrane by it surgical removal, there was a large expression of alpha-SMA identifying the myofibroblasts and the consequent development of scars responsible for the loss of corneal transparency. Conclusion: The excimer laser use on the anterior surface caused destruction to the corneal innervation. However, the regenerative capacity of nerve fibers was demonstrated over the months, despite the persistence of anomalous architecture and redistribution of the corneal nerves that persisted even after six months. MMC exhibited a moderate and early neurotoxic effect when combined with the excimer laser treatment at the concentration and time used in this study At the inferior third of the cornea, Descemet\'s membrane exhibited an important role during the modulation process of scarring or fibrosis in the deep stroma. Once damaged, a constant influx of inflammatory cytokines into the stroma was guaranteed and a differentiation and persistence of the myofibroblast occur. This process has been shown to be analogous to the role of the corneal epithelial basement membrane as a regulator of the anterior cornea fibrosis process
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02072019-152249 |
| Date | 17 April 2019 |
| Creators | Medeiros, Carla Santos |
| Contributors | Santhiago, Marcony Rodrigues de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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