Objetivo: Determinar o processo cicatricial e regenerativo da córnea em suas diferentes camadas diante do dano cirúrgico, através da Ceratectomia Fotorrefrativa (PRK) nos terços anteriores ou injúria do complexo Descemetendotélio no terço posterior. Métodos: Córneas de coelhos foram utilizadas a fim de identificar os nervos presentes, evidenciados através da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) da acetilcolinesterase (AchE) e expressos numericamente após quantificação automatizada pelo software Image-Pro. Os seguintes grupos foram incluídos nessa análise: remoção do epitélio com e sem Mitomicina (MMC) 0.02%, -9.0D PRK com e sem MMC. O dano e a regeneração dos nervos foram avaliados através da análise dos grupos após 1 dia, 1, 2, 3 e 6 meses. A morfologia e a distribuição dos nervos foram realizadas através do estudo da tubulina Beta-III, um marcador de microtúbulos presentes em neurônios. Na córnea posterior, a fim de identificar a ocorrência de apoptose após a injúria mecânica do endotélio através de uma cânula romba, cortes desse tecido foram avaliados por meio de técnicas de IHQ através do método de fragmentação do DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase (TUNEL) e microscopia de transmissão eletrônica (TEM) após 1 e 4 horas. A ocorrência de fibrose subsequente à lesão da córnea posterior foi avaliada nos grupos submetidos à Descemetorréxis ou à injúria mecânica do endotélio isolado após 1 mês. O estudo imunohistoquímico para actina de músculo liso (alfa-SMA) permitiu identificar a presença de miofibroblastos e a identificação morfológica da membrana de Descemet demonstrada através do Nidogênio-1 (Nid-1), tornando possível, portanto, a discriminação do papel das camadas posteriores no processo cicatricial da córnea. Olhos contralaterais foram incluídos como um grupo controle em todas as análises. Resultados: Na face anterior da córnea, uma menor área do complexo nervoso foi observada um dia após o PRK associado ao uso da MMC (p=0.0009) quandocomparado ao PRK sem o uso da medicação, que não se manteve após um mês (p=0.9). O PRK sem MMC demonstrou uma crescente capacidade regenerativa de seus nervos, que apresentaram valores comparáveis aos pré-operatórios após o terceiro mês. No entanto, tais fibras nervosas apresentaram uma morfologia aberrada mantida até a análise do mês seis. Na face posterior da córnea, apesar da presença de células TUNEL+ após 1 e 4 horas subsequentes ao dano mecânico do endotélio isolado, não houve a expressão de alfa-SMA no estroma posterior após um mês. A integridade estrutural da membrana de Descemet nesse grupo foi confirmada através do Nidogênio-1 (Nid-1), diferentemente do observado após o dano ao complexo Descemet-endotélio, em que houve ampla expressão de alfa-SMA identificando a presença de miofibroblastos e o consequente desenvolvimento de cicatrizes responsáveis pela perda de transparência na córnea. Conclusão: O uso do excimer laser na superfície anterior causou prejuízo à inervação da córnea. Todavia, a capacidade regenerativa das fibras nervosas foi demonstrada ao longo dos meses, apesar da persistência de uma anômala arquitetura e redistribuição dos nervos mesmo após o sexto mês. A MMC revelou uma discreta e precoce propriedade neurotóxica quando combinada ao uso do excimer laser, que não implica perda da segurança a médio/longo prazo do uso dessa droga na concentração e tempos utilizados nesse estudo. No terço posterior da córnea, a membrana de Descemet exibiu um importante papel modulador no processo de desenvolvimento de cicatrizes ou fibrose no estroma profundo. Uma vez lesada, torna constante o influxo de citocinas inflamatórias necessárias para a diferenciação e persistência do miofibroblasto. Tal processo mostrou-se análogo ao papel da membrana basal do epitélio como reguladora do processo de fibrose da córnea anterior / Purpose: To determine the wound-healing cascade and regeneration process of the cornea after surgical injury in its different layers, through Photorefractive Keratectomy (PRK) in the anterior thirds or Descemet-endothelium injury in the posterior third. Methods: Rabbit corneas were used to identify the nerves present in the central area of this tissue by the immunohistochemistry (IHQ) technique of acetylcholinesterase (AchE) and their numerical quantification by Image-Pro software. The following groups were included in this analysis: Removal of epithelium with and without Mitomycin (MMC) 0.02 %, -9.0D PRK with and without MMC. Damage and nerve regeneration were assessed by analyzing the groups after 1 day, 1, 2, 3 and 6 months. The morphology and distribution of nerves along the corneal layers was performed through tubulin beta-III study. At the posterior cornea, to distinguish the occurrence of apoptosis after the mechanical injury of the endothelium through a blunt cannula, sections of this tissue were evaluated by IHQ technique through DNA fragmentation by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase (TUNEL) and electron transmission microscopy (TEM) after 1 and 4 hours. The occurrence of cornea fibrosis subsequent to posterior corneal injury was evaluated by the group undergoing Descemet membrane surgical removal or by the endothelium mechanical injury after 1 month. The immunohistochemical study for smooth muscle actin (alpha-SMA) allowed the identification of myofibroblasts and the structural integrity of Descemet demonstrated by Nidogen-1 (Nid-1). Thus, making it possible to discriminate the role of the posterior layers during the corneal wound-healing process. Contralateral eyes were included as a control group in all analyzes. Results: At the anterior surface of the cornea, a smaller area of the nervous complex was observed one day after PRK associated with the use of MMC (p = 0.0009) when compared to PRK without the association of the drug, which was not maintained after the first month (p = 0.9). The PRK without MMC demonstrated an increasing regenerative capacity of their nerves, which presented values comparable to preoperative measurements after the third month. However, morphological differences and an aberrant distribution of innervation were persistent. At the corneal posterior surface, despite the presence of TUNEL + cells after 1 and 4 hours subsequent to the mechanical damage of the isolated endothelium, there was no alpha-SMA expression in the posterior stroma after one month. The structural integrity of Descemet\'s membrane in this group was confirmed by Nidogen-1 (Nid-1). Differently from what was observed after damage to the Descemet membrane by it surgical removal, there was a large expression of alpha-SMA identifying the myofibroblasts and the consequent development of scars responsible for the loss of corneal transparency. Conclusion: The excimer laser use on the anterior surface caused destruction to the corneal innervation. However, the regenerative capacity of nerve fibers was demonstrated over the months, despite the persistence of anomalous architecture and redistribution of the corneal nerves that persisted even after six months. MMC exhibited a moderate and early neurotoxic effect when combined with the excimer laser treatment at the concentration and time used in this study At the inferior third of the cornea, Descemet\'s membrane exhibited an important role during the modulation process of scarring or fibrosis in the deep stroma. Once damaged, a constant influx of inflammatory cytokines into the stroma was guaranteed and a differentiation and persistence of the myofibroblast occur. This process has been shown to be analogous to the role of the corneal epithelial basement membrane as a regulator of the anterior cornea fibrosis process

OBJETIVOS: Determinar a correlação entre a completa regeneração da membrana basal epitelial (MBE) e o desaparecimento de miofibroblastos do estroma anterior e consequente restauração da transparência corneana após diferentes mecanismos de trauma em coelhos. MÉTODOS: Foram utilizados 32 coelhos que tiveram um de seus olhos incluídos em um dos três grupos de estudo: (1) -9 dioptrias (D) ceratectomia fotorrefrativa (PRK), (2) Incisões corneanas verticais de espessura parcial (350 um), ou (3) Ceratite bacteriana, enquanto os olhos contralaterais compuseram o grupo controle. Os animais foram examinados, sacrificados, e tiveram suas córneas analisadas em diferentes momentos afim de investigar com detalhes o processo de cicatrização corneano usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) e microscopia de transmissão eletrônica (MTE). RESULTADOS: No grupo \"-9D PRK\", as córneas apresentavam opacidade corneana densa e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia, no entanto, pequenas áreas de córnea transparente começaram a surgir em meio à opacidade difusa, correspondendo a pequenas ilhas de MBE completamente regenerada. Após 4 meses da cirurgia a MBE estava completamente regenerada e a transparência corneana havia sido reestabelecida na região ablada pelo laser. No grupo \"incisões corneanas\", o par de densas opacidades corneanas lineares observadas após 1 mês do procedimento tornou-se progressivamente mais tênue ao longo dos próximos 2 meses. A ultraestrutura da MBE estava completamente regenerada e não houve formação de miofibroblastos no local das incisões 1 mês após o procedimento, inclusive ao redor dos plugs epiteliais que se estendiam até o estroma. No grupo \"ceratite bacteriana\", as córneas que haviam sido infectadas apresentaram opacidade densa, vascularização, miofibroblastos em toda a sua espessura, e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a infecção. Observou-se ao longo dos próximos 3 meses substancial redução da opacidade, evidências ultraestruturais de regeneração da MBE, e desaparecimento de miofibroblastos das porções mais anteriores do estroma, persistindo apenas nas regiões do estroma mais posterior nas quais o endotélio e a membrana de Descemet encontravam-se lesadas. CONCLUSÃO: No modelo animal apresentado, a resolução espontânea da opacidade corneana tardia mediada por miofibroblastos após a ablação com excimer laser ou ceratites infeciosas graves é desencadeada pela completa regeneração da estrutura e função da MBE. As incisões corneanas de espessura parcial em coelhos, no entanto, cicatrizam sem geração de miofibroblastos devido à completa regeneração da MBE após 1 mês do procedimento. Determinou-se, portanto, a correlação entre a reparação da membrana basal epitelial e a consequente redução da opacidade e restauração da transparência corneana / PURPOSE: To determine the correlation between epithelial basement membrane (EBM) regeneration and the disappearance of myofibroblasts from anterior stroma and consequent restoration of corneal transparency after different types of injury in rabbits. METHODS: Thirty-two rabbits had one of their eyes included in one of the 3 study groups: (1) -9 diopters (D) photorefractive keratectomy (PRK), (2) Two vertical partial-thickness (350 um) corneal incisions, or (3) Bacterial keratitis, whereas the opposite eyes served as unwounded control group. The animals were examined, sacrificed, and had their corneas analysed in different time points in order to investigate the corneal wound healing process using immunohistochemistry and transmission electron microscopy. RESULTS: In the \"-9D PRK\" group, corneas at 1 month after surgery had dense corneal opacity and no evidence of regenerated EBM. However, by 2 months after surgery small areas of stromal clearing began to appear within the confluent opacity, and these corresponded to small islands of normally regenerated EBM. By 4 months after surgery, the EBM was fully regenerated and the corneal transparency was completely restored in the ablated zone. In the \"corneal incisions\" group, the two dense, linear corneal opacities observed at 1 month after the procedure progressively faded during the next 2 months. The EBM ultrastructure was fully regenerated and there were no myofibroblasts at the site of the incisions by 1 month after the procedure, including around the epithelial plugs that extended into the stroma. In the \"bacterial keratitis\" group, all the corneas that have been infected presented dense stromal scarring, vascularization, myofibroblasts in the full stromal thickness and no evidence of EBM regeneration by 1 month after the infection. There was a definite decrease in opacity during the next 3 months, besides ultrastructural evidence of EBM regeneration and disappearance of myofibroblasts in the most anterior part of the stroma, which persisted only in the most posterior stroma where the endothelium and Descemet\'s membrane were damaged. CONCLUSION: In the rabbit model, spontaneous resolution of myofibroblast-mediated corneal opacity (fibrosis) after high correction PRK or infectious keratitis is triggered by regeneration of normal EBM structure and function. Conversely, incisional wounds heal in rabbit corneas without the development of myofibroblasts because the EBM regenerates normally by 1 month after the injury. Therefore, it has been determined the correlation between the EBM regeneration and the restoration of corneal transparency after different types of corneal injury

OBJETIVOS: Determinar a correlação entre a completa regeneração da membrana basal epitelial (MBE) e o desaparecimento de miofibroblastos do estroma anterior e consequente restauração da transparência corneana após diferentes mecanismos de trauma em coelhos. MÉTODOS: Foram utilizados 32 coelhos que tiveram um de seus olhos incluídos em um dos três grupos de estudo: (1) -9 dioptrias (D) ceratectomia fotorrefrativa (PRK), (2) Incisões corneanas verticais de espessura parcial (350 um), ou (3) Ceratite bacteriana, enquanto os olhos contralaterais compuseram o grupo controle. Os animais foram examinados, sacrificados, e tiveram suas córneas analisadas em diferentes momentos afim de investigar com detalhes o processo de cicatrização corneano usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) e microscopia de transmissão eletrônica (MTE). RESULTADOS: No grupo \"-9D PRK\", as córneas apresentavam opacidade corneana densa e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia, no entanto, pequenas áreas de córnea transparente começaram a surgir em meio à opacidade difusa, correspondendo a pequenas ilhas de MBE completamente regenerada. Após 4 meses da cirurgia a MBE estava completamente regenerada e a transparência corneana havia sido reestabelecida na região ablada pelo laser. No grupo \"incisões corneanas\", o par de densas opacidades corneanas lineares observadas após 1 mês do procedimento tornou-se progressivamente mais tênue ao longo dos próximos 2 meses. A ultraestrutura da MBE estava completamente regenerada e não houve formação de miofibroblastos no local das incisões 1 mês após o procedimento, inclusive ao redor dos plugs epiteliais que se estendiam até o estroma. No grupo \"ceratite bacteriana\", as córneas que haviam sido infectadas apresentaram opacidade densa, vascularização, miofibroblastos em toda a sua espessura, e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a infecção. Observou-se ao longo dos próximos 3 meses substancial redução da opacidade, evidências ultraestruturais de regeneração da MBE, e desaparecimento de miofibroblastos das porções mais anteriores do estroma, persistindo apenas nas regiões do estroma mais posterior nas quais o endotélio e a membrana de Descemet encontravam-se lesadas. CONCLUSÃO: No modelo animal apresentado, a resolução espontânea da opacidade corneana tardia mediada por miofibroblastos após a ablação com excimer laser ou ceratites infeciosas graves é desencadeada pela completa regeneração da estrutura e função da MBE. As incisões corneanas de espessura parcial em coelhos, no entanto, cicatrizam sem geração de miofibroblastos devido à completa regeneração da MBE após 1 mês do procedimento. Determinou-se, portanto, a correlação entre a reparação da membrana basal epitelial e a consequente redução da opacidade e restauração da transparência corneana / PURPOSE: To determine the correlation between epithelial basement membrane (EBM) regeneration and the disappearance of myofibroblasts from anterior stroma and consequent restoration of corneal transparency after different types of injury in rabbits. METHODS: Thirty-two rabbits had one of their eyes included in one of the 3 study groups: (1) -9 diopters (D) photorefractive keratectomy (PRK), (2) Two vertical partial-thickness (350 um) corneal incisions, or (3) Bacterial keratitis, whereas the opposite eyes served as unwounded control group. The animals were examined, sacrificed, and had their corneas analysed in different time points in order to investigate the corneal wound healing process using immunohistochemistry and transmission electron microscopy. RESULTS: In the \"-9D PRK\" group, corneas at 1 month after surgery had dense corneal opacity and no evidence of regenerated EBM. However, by 2 months after surgery small areas of stromal clearing began to appear within the confluent opacity, and these corresponded to small islands of normally regenerated EBM. By 4 months after surgery, the EBM was fully regenerated and the corneal transparency was completely restored in the ablated zone. In the \"corneal incisions\" group, the two dense, linear corneal opacities observed at 1 month after the procedure progressively faded during the next 2 months. The EBM ultrastructure was fully regenerated and there were no myofibroblasts at the site of the incisions by 1 month after the procedure, including around the epithelial plugs that extended into the stroma. In the \"bacterial keratitis\" group, all the corneas that have been infected presented dense stromal scarring, vascularization, myofibroblasts in the full stromal thickness and no evidence of EBM regeneration by 1 month after the infection. There was a definite decrease in opacity during the next 3 months, besides ultrastructural evidence of EBM regeneration and disappearance of myofibroblasts in the most anterior part of the stroma, which persisted only in the most posterior stroma where the endothelium and Descemet\'s membrane were damaged. CONCLUSION: In the rabbit model, spontaneous resolution of myofibroblast-mediated corneal opacity (fibrosis) after high correction PRK or infectious keratitis is triggered by regeneration of normal EBM structure and function. Conversely, incisional wounds heal in rabbit corneas without the development of myofibroblasts because the EBM regenerates normally by 1 month after the injury. Therefore, it has been determined the correlation between the EBM regeneration and the restoration of corneal transparency after different types of corneal injury

Thesis (M.S.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2005. / Typescript (photocopy).