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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer em mulheres no mundo. De
acordo com o Instituto Nacional do Câncer, 7.470 novos casos são estimados em 2010
apenas no Rio de Janeiro. A maioria dos casos de câncer de mama são originados nas células
ductais mamárias. Elas secretam o fluido aspirado de mama (NAF), que contém proteínas
intimamente associadas ao microambiente tumoral. O objetivo deste trabalho foi utilizar a
abordagem proteômica como ferramenta para caracterizar e comparar o NAF das duas
mamas de pacientes brasileiras com câncer da mama unilateral. A concentração média de
proteínas das amostras controle, tumor benigno ou câncer de mama de 13 mulheres foi
aproximadamente 115 ± 60 μg/μL. A atividade proteolítica do NAF foi visualizada por
zimografia das amostras de duas pacientes. Observamos que o padrão de bandas
gelatinolíticas diferiu substancialmente entre as pacientes, mas não entre as duas mamas do
mesmo indivíduo. As enzimas proteolíticas se apresentaram sensíveis à inibição por agentes
quelantes de metais (EDTA e orto-fenantrolina). As amostras de NAF também foram
submetidas à 2D-PAGE em condições otimizadas (IPG 4-7 e aplicação de amostra por
reidratação in gel) e poucos spotsproteicos muito abundantes foram detectados e
identificados por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF como albumina,
imunoglobulinas, zinco-α2-glicoproteína e proteína induzida por prolactina. Para enriquecer
o NAF em suas proteínas menos abundantes, testamos estratégias de depleção usando a
coluna de múltipla afinidade Hu-6 da Agilent ou proteína L agarose. Este passo de pré-fracionamento introduziu variabilidade adicional importante nas amostras e por este motivo
não foi empregado em etapas posteriores do estudo. Catorze amostras de NAF das mamas
pareadas de mulheres com câncer unilateral foram sistematicamente comparadas por 2D-DIGE. Foram observadas diferenças qualitativas substanciais entre as pacientes,
prejudicando as comparações quantitativas entre as amostras. Dois grandes perfis proteicos
distintos foram definidos por 2D-DIGE. O perfil A caracterizou-se pela presença de dois
grupos de spotsácidos típicos (pI ≈ 4,5 e MM 29,5 e 18 kDa), ausentes no perfil B. A
presença de glico- e fosfo-proteínas foi determinada em amostras de ambos os perfis após
revelação dos géis 2D com ProQ- Emerald ou Diamond,respectivamente. As amostras dos
dois perfis se mostraram muito mais ricas em glicoproteínas do que em fosfoproteínas. Este
trabalho constituiu a primeira caracterização proteômica sistemática do NAF de pacientes
brasileiras com câncer de mama unilateral. Nossos resultados mostraram uma variabilidade
importante do conteúdo de proteínas nas amostras individuais de NAF, sugerindo a
necessidade de uma estratificação mais uniforme daspacientes. Por fim, o emprego de
tecnologias proteômicas mais sensíveis e acuradas deverá ser necessário para possibilitar a
detecção e identificação de proteínas menos abundantes no NAF, que poderão constituir
candidatos a biomarcadores do câncer de mama. / Breast cancer is the main cause of cancer deaths worldwide in women. According to the
Instituto Nacional do Câncer, 7.470 new cases are estimated for 2010 in Rio de Janeiro. Most
breast cancer cases originate from mammary ductal cells that secrete the nipple aspirate
fluid (NAF), witch contains proteins associated with the breast cancer microenvironment.
The aim of this study was to use the proteomic approach as a reliable tool to characterize
NAF samples from brazilian patients with unilateralbreast cancer. The mean concentration
of NAF proteins from healthy, benign or cancer breast samples from 13 women was
approximately 115 ±60 μg/μL. The proteolytic activity of NAF samples from both breasts of
two patients was visualized by SDS-PAGE zymography.The patterns of gelatinolytic bands
differed substantially between patients but were very similar within the same patient. The
proteolytic activity was sensible to inhibition by metal quelators (EDTA and
orthophenantrolin). In this study, NAF samples weresubmitted to 2D-PAGE under optimized
conditions (IPG 4-7 and sample in gel rehydratation) and a few very abundant protein spots
were detected. They were identified by MALDI-TOF/TOF MS as albumin, immunoglobulins,
zinc-α2-glycoprotein and prolactin-induced protein.To enrich NAF for less abundant
proteins, we tested protein depletion using AgilentHu-6 column or Protein L Agarose. These
pre-fractionation steps introduced important additional variability in the samples and were
not further used. Fourteen NAF samples from tumorous and non-tumorous breasts of
women with unilateral cancer were systematically compared by 2D-DIGE. Substantial
qualitative individual differences were observed, impairing proper quantitative comparisons.
Two main 2D-DIGE protein profiles were observed: profile A was characterized by two
groups of acidic spots (pI ≈ 4,5 and MM 29,5 and 18kDa), not detected in profile B. The
presence of glyco- and phosphoproteins was determined after staining NAF 2D gels with
ProQ-Emerald or Diamond, respectively. The samples from both profiles were much richer in
glycoproteins than phosphoproteins. This work was the first systematic proteomic
characterization of NAF from brazilian patients with unilateral breast cancer. The results
highlight important variability in the protein content of NAF samples, suggesting that a more
uniform patient stratification and the use of more sensible and accurate proteomic
technologies will be needed for the detection and identification of breast cancer biomarker
candidates.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6056 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Brunoro, Giselle Villa Flor |
| Contributors | Bozza, Patricia Torres, Gallo, Claudia Vitoria de Moura, Domont, Gilberto Barbosa, Barboza, Luciana Pizzatti, Valente, Richard Hemmi, Ferreira, Ana Gisele da Costa Neves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Giselle Villa Flor Brunoro, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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