A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25022016-093904 |
| Date | 05 November 2015 |
| Creators | Soler, Matheus Francisco de Carvalho Rosa |
| Contributors | Silva, Silvio Silverio da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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