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Previous issue date: 2018-07-30 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The objective of this work was to study the effect of the insulin like growth factor-1(IGF-1) and growth differentiation factor-9 (GDF-9) on the in vitro development of sheep preantral follicles. For this, three experimental phases were developed. The first phase evaluated the effect of IGF-I on the in vitro culture of sheep isolated secondary follicles. Sixteen ovaries were allocated for the immunolocalization of IGF-I protein. Isolated secondary follicles of other ovaries were cultured for 18 days in control medium (MEM+) or MEM+ supplemented with different concentrations of IGF-I (10, 50 and 100 ng/mL) or the same treatments with the addition of 750 ng/ml of FSH. At the end of the culture, fluorescence, in vitro maturation (IVM) or LH receptor (LHR) expression analyzes were performed. Phase 2 evaluated the influence of GDF-9 on the development of preantral follicles cultured in situ. For this, ovarian fragments were cultured for 7 days in MEM or in MEM supplemented with of GDF-9 (1, 50, 100, 200 or 400 ng/mL). In addition, a second culture in MEM or MEM + 50 ng/mL of GDF-9 was performed in the presence or absence of the PI3K pathway inhibitor. At the end of culture, follicular survival, activation and diameter, immunolocalization of PCNA, activated caspase-3 and pAKT proteins were evaluated. In the phase three, isolated secondary follicles were cultured for 12 days in MEM or MEM + GDF-9 (1, 10, 50 or 100 ng/mL). At the end of culture, oocytes were submitted to IVM, follow by mitochondrial activity and ROS analysis. The results of phase 1 showed that 50 ng/mL of IGF-I + FSH showed more fully-grown oocytes (P <0.05). ROS levels were higher in 100 ng/mL IGF-I + FSH compared to the other groups, with a concomitant decrease of GSH level and mitochondrial activity (P <0.05). In the second phase, follicular survival was higher with the concentration of 50 ng/ml of GFD-9 (P <0.05) compared to other treatments (except 1 ng/mL) concomitant with a greater proliferation and lower apoptosis compared to the control, through of PI3K/AKT pathway. In the last phase, the follicles cultured in 100 ng/ml GDF-9 showed a higher percentage of fully-grown oocytes, MI and higher mitochondrial activity compared to other groups (P <0.05). In conclusion, this study demonstrated the presence of IGF-I protein in sheep ovary. In addition, 50 ng/mL of IGF-I + FSH promotes follicular development and meiotically competent oocytes. The concentration of 50 ng/ml of GDF-9 maintains the survival of primordial follicles cultured in situ, increases cell proliferation and decreases apoptosis via the PI3K/AKT pathway. In isolated secondary follicles, GDF-9 increases the percentage of fully-grown oocytes able to resume meiosis, and enhances mitochondrial activity after IVM. / O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I) e do fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais ovinos. Para isto, foram desenvolvidas três fases experimentais. A primeira fase avaliou o efeito do IGF-I sobre o cultivo in vitro de folículos secundários isolados de ovelhas. Parte dos ovários foram destinados à imunolocalização da proteína para o IGF-I. Os folículos secundários isolados dos demais ovários foram cultivados por 18 dias no meio controle (MEM+) ou no MEM+ associado de diferentes concentrações de IGF-I (10, 50 e 100 ng/mL), ou nos mesmos tratamentos adicionados de 750 ng/mL de FSH. Ao final do cultivo, foram realizadas análises de fluorescência, maturação in vitro (MIV) ou expressão do receptor de LH (LHR). A fase 2 avaliou a influência do GDF-9 no desenvolvimento de folículos pré-antrais cultivados in situ. Para isso, fragmentos ovarianos foram cultivados por 7 dias em MEM ou em MEM adicionado de GDF-9 (1, 50, 100, 200 ou 400 ng/mL). Além disso, foi realizado um segundo cultivo em MEM ou em MEM + 50 ng/mL de GDF-9, na presença ou ausência do inbidor da via PI3K. Ao final, os fragmentos foram avaliados quanto à sobrevivência, ativação, diâmetro e imunolocalização das proteínas PCNA, caspase-3 ativada e pAKT. Na fase três, folículos secundários isolados foram cultivados por 12 dias em MEM ou MEM + GDF-9 (1, 10, 50 ou 100 ng/mL). Ao final do cultivo, os oócitos foram submetidos à MIV e, posteriormente, à análise de atividade mitocondrial e ERO. Os resultados da fase 1 mostraram que 50 ng/mL de IGF-I + FSH apresentou mais oócitos totalmente crescidos (P<0,05). Os níveis de ERO foram maiores em 100 ng/mL de IGF-I + FSH comparado aos outros grupos, com concomitante diminuição do nível de GSH e atividade mitocondrial (P<0,05). Na fase 2, a sobrevivência folicular foi maior no tratamento 50 ng/mL de GFD-9 (P<0,05) comparado aos demais tratamentos (exceto 1 ng/mL), promoveu maior proliferação celular e reduziu a apoptose quando comparado ao controle, o que ocorreu através da via PI3K/AKT. Na fase 3, os folículos cultivados em 100 ng/mL de GDF-9 apresentaram maior percentagem de oócitos totalmente crescidos, MI e maior atividade mitocondrial comparado aos demais grupos (P<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou a presença da proteína para o IGF-I em ovários ovinos. Além disso, 50 ng/mL de IGF-I + FSH promove o desenvolvimento de folículos e de oócitos meioticamente competentes. A concentração de 50 ng/mL de GDF-9 mantém a sobrevivência de folículos primordiais cultivados in situ, aumenta a proliferação celular e diminui a apoptose através da via PI3K/AKT. Em folículos secundários isolados, o GDF-9 aumenta a percentagem de oócitos totalmente crescidos, aptos a retomar a meiose, e aumenta a atividade mitocondrial após a MIV.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/7650 |
| Date | 30 July 2018 |
| Creators | MONTE, Alane Pains Oliveira do |
| Contributors | MATOS, Maria Helena Tavares de, ALMEIDA, Jackson Roberto Guedes da Silva, QUEIROZ, Mário Adriano Ávila, ARAÚJO, Valdevane Rocha, DONFACK, Nathalie Jiatsa |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (Renorbio), UFRPE, Brasil, Rede Nordeste de Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 7794227690756777355, 600, 600, 600, 600, -8104576588452276421, 6209957791494323825, -2555911436985713659 |
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