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Previous issue date: 2016-12-19 / Outro / The xylan-degrading enzymes are responsible for the hydrolysis of xylan and can be produced by a variety of microorganisms such as bacteria and fungi. Bacteria produce an effective xylanolytic system composed of endoxylanase, β-xylosidases, arabinofuronosidases, glucuronidases, acetyl xylan esterase and esterase ferulic acid and have been the target of several studies on the production and application of these enzymes in biotechnological processes such as hydrolysis of different substrates to obtain fermentable sugars. Actinomycetes comprising a phylum Gram positive, aerobic, which generally form branched filaments, often in the form of mycelium. Among the actinomycetes, bacteria of the genus Streptomyces in particular, have been studied due to their important role biotechnology. In the present study, we report the expression, purification and characterization of xylanase (XynBS27) recombinantly in yeast P. pastoris. To achieve high levels of production, the gene was designed and synthesized by optimizing codon usage for P. pastoris. The synthetic gene (xynBS27) was cloned into expression vector containing the AOXI promoter followed by integration into the yeast genome. The increased production of XynBS27 was after 96 h of induction, 2% methanol at 28 °C and 200 rpm (80 U/mL), the enzyme was purified in one chromatography step molecular exclusion obtained specific activity of 8525 U/ mg its highest activity at 75 °C and pH 6, it is thermostable and showed stability at pH 5, 6 and 7. The XynBS27 has a molecular mass of 19 kDa active in zymography. Many ions were tested Al3+, NH4+, Ba2+ and Mg2+ were inducers and Ag+ ions, Hg2+ and Cu2+ inhibited, the sulfides of Mn2+, Zn2+, Fe3+ and denaturing agents EDTA and SDS inhibited XynBS27. The enzyme is tolerant to high concentrations of glucose and xylose. The Km and Vmax values were 12.38 mg/mL, 13.679 mmol/(min.mL), respectively, Ki of 180 mM competitive inhibition. The use of the enzyme in baking has proved very promising in the evaluated parameters, volume, density, reducing sugar, stiffness, consistency, firmness and water retention. / As enzimas xilanolíticas são responsáveis pela hidrólise da xilana e podem ser produzidas por uma variedade de micro-organismos como bactérias e fungos. As bactérias produzem um eficiente sistema xilanolítico composto de endoxilanases, β-xilosidases, arabinofuranosidases, glucuronidases, acetil xilana esterase e ácido ferúlico esterase e tem sido alvo de diversos estudos sobre a produção e aplicação destas enzimas em processos biotecnológicos, como a hidrólise de diferentes substratos para obtenção de açúcares fermentáveis. Entre os actinomicetos, as bactérias do gênero Streptomyces em particular, têm sido estudadas devido ao seu importante papel biotecnológico. No presente estudo, é relatada a expressão do gene, purificação e caracterização da xilanase (XynBS27) recombinante pela levedura P. pastoris. Para alcançar altos níveis de produção, o gene foi desenhado e sintetizado, otimizando o códon usage para P. pastoris. O gene sintético (xynBS27) foi clonado em vetor de expressão contendo o promotor AOXI, seguindo-se da integração no genoma da levedura. A maior produção da XynBS27 foi obtida após 96 h de indução, 2% de metanol, à 28 ºC e 200 r.p.m. (80 U/mL), a enzima foi purificada por de cromatografia de exclusão molecular, apresentando atividade específica de 8525 U/mg, sua maior atividade foi a 75 ºC e pH 6, se mostrou termo estável e apresentou estabilidade em pH 5, 6 e 7. A XynBS27 apresenta massa molecular de 19 kDa é ativa em zimograma. Diversos íons foram testados, sendo o Al3+, NH4+, Ba2+ e o Mg2+ indutores e os íons Ag+, Hg2+ e Cu2+ inibidores, os sulfetos de Mn2+, Zn2+, Fe3+ e os agentes desnaturantes EDTA e SDS também inibiram a XynBS27. A enzima é tolerante à altas concentrações de glicose e xilose. Os valores de Km e Vmáx foram 12,38 mg/mL e 13,679 µmol/(min.mL), respectivamente em xilana, Ki de 180 mM de xilose, indicando inibição competitiva. A utilização da enzima na panificação mostrou-se muito promissora em relação aos parâmetros avaliados, volume, densidade, açúcar redutor, rigidez, consistência, firmeza e retenção de água.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/6865 |
| Date | 19 December 2016 |
| Creators | Cunha, Carolina Cândida de Queiroz Brito |
| Contributors | Ulhoa, Cirano José, Bataus, Luiz Artur Mendes, Faria, Fabricia Paula de, Georg, Raphaela de Castro, Colussi, Francieli, Steindorff, Andrei Stecca, Ulhoa, Cirano José |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Biologia (ICB), UFG, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas - ICB (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 6883982777473437920, 600, 600, 600, 600, 600, -3872772117827373404, 893477990329266114, -5518144268585252051, 2442915598251853972 |
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