Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06012017-165041 |
| Date | 26 September 2016 |
| Creators | Landgraf, Taise Natali |
| Contributors | Castelo, Ademilson Panunto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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