A resposta inflamatória uterina pós-cobertura ocorre para remoção de espermatozoides e contaminantes; todavia, o atraso em debelar este processo têm sido identificado, em equinos, como a principal causa de endometrite persistente pós-cobertura. A pentoxifilina atua como um inibidor da fosfodiesterase e aumenta as características de motilidade espermática, ainda tem sido relatada sua participação como agente reológico, aumentando o fluxo sanguíneo de tecidos comprometidos, e como agente imunomodulador. O propósito deste estudo foi examinar os efeitos da pentoxifilina adicionada ao diluidor seminal pós-descongelação, sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e integridade de cromatina, bem como sobre a resposta inflamatória uterina após a inseminação artificial de éguas. Dez partidas de sêmen de um único garanhão foram criopreservadas (100x106 espermatozoides/palheta 0,5 mL) em sistema automatizado (TK 3000) e mantidas em botijão criogênico, sendo posteriormente utilizadas para análises laboratoriais e inseminação artificial. Para análise laboratorial duas palhetas de sêmen de cada partida foram descongeladas (37ºC/30 segundos) e diluídas em diluidor à base de leite desnatado (controle) e diluidor à base de leite desnatado contendo pentoxifilina (7,18 mM). As alíquotas de cada tratamento foram mantidas em banho-Maria seco (37°C) e analisadas em quatro momentos: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) e 120 minutos (T120) pós-diluição e incubação. As amostras foram analisadas quanto às características de movimento espermático, por sistema computadorizado de análise espermática (CASA), membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial por associação de sondas fluorescentes (PI, H342, FITC-PSA e JC-1), morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e integridade da cromatina pelo Azul de Toluidina. Para avaliar os efeitos do diluidor contendo ou não pentoxifilina na resposta inflamatória uterina, foram utilizadas 15 éguas distribuídas em cinco grupos: Grupo Control (controle): sem deposição de sêmen, nem diluidor, mimetizando-se o procedimento da IA; Grupo SM Extender: deposição de diluidor sem pentoxifilina (Botusemen®, Botupharma); Grupo SM Extender + PTX: deposição de diluidor contendo pentoxifilina; Grupo Sêmen: deposição de sêmen diluído com diluidor sem pentoxifilina; Grupo Sêmen + PTX: deposição de sêmen diluído com diluidor contendo pentoxifilina (7,18 mM). A hemodinâmica uterina foi avaliada por ultrassonografia nos modo color e espectral realizadas nos períodos: imediatamente antes da indução da ovulação (aproximadamente 30 horas antes da IA, T-30), imediatamente antes da inseminação artificial (TIA) e 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) e 48 (T48) horas após a inseminação artificial. Uma amostra para citologia endometrial foi coletada, por escova ginecológica no momento T6. A análise estatística foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA), sendo as médias comparadas pelo LSD test, SAS versão 9.3 (2010). A adição de pentoxifilina não exerceu efeito sobre a motilidade progressiva, porém, a pentoxifilina aumentou velocidade de trajeto, velocidade progressiva e velocidade curvilinear quando comparada ao controle. Não houve diferença significativa na porcentagem de células apresentando membrana plasmática intacta, acrossoma intacto e alto potencial mitocondrial (PIAIC). Nenhuma diferença estatística foi encontrada no fluxo sanguíneo uterino de éguas após os tratamentos. Porém, a citologia endometrial demonstrou maior resposta inflamatória em grupos contendo pentoxifilina quando comparado aos controles. Concluiu-se que a pentoxifilina exerce efeito positivo sobre parâmetros de velocidade, mas não influencia as membranas celulares e a cromatina. No entanto, quando as éguas são inseminadas com sêmen contendo pentoxifilina, uma resposta inflamatória mais intensa é observada. / The post breeding uterine inflammatory response occurs due to remove spermatozoa and contaminants; however, delayed uterine clearance has been identified, in equines, as the underlying cause of persistent post breeding endometritis. Pentoxifylline acts as a phosphodiesterase inhibitor and increases sperm motion characteristics, and it has been reported to participate as a rheologic agent, improving blood flow to compromised tissues, and as an immunomodulatory agent. The purpose of this study was to examine the effects of pentoxifylline added to the seminal extender after thawing, on sperm motion, plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes and chromatin integrities, as well as the uterine inflammatory response on mares after artificial insemination. Ten batches of a unique stallion were cryopreserved (100x106 spermatozoa/0.5 mL straws), in an automated system (TK 3000) and storaged in cryogenic cylinder for posterior use for laboratory analysis and artificial insemination. For laboratory analysis two semen straws of each batch were thawed (37°C/30 seconds) and diluted in skim milk based extender (control) or diluted in skim milk extender containing pentoxifylline (7.18 mM). Aliquots of each treatment were maintained in dry water bath (37°C) and analyzed at four moments: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) and 120 minutes (T120) post dilution and incubation. Samples were analyzed for sperm motion characteristics, through Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes through fluorescent probes association (PI, H342, FITC-PSA and JC-1), spermatic morphology through differential interference contrast and chromatin integrity through Toluidine blue. To examine the effect of extender containing or not pentoxifylline on uterine inflammatory response 15 mares were divided into 5 groups: Group Ccontrol (control): no uterine deposition of semen, or extender, just mimicking the AI procedure; Group SM Extender: deposition of skim milk based extender (Botusemen®, Botupharma); Group SM Extender + PTX: deposition of skim milk based extender containing Pentoxifylline; Group Semen: deposition of semen diluted with extender only; Group Semen + PTX: deposition of semen diluted with extender containing Pentoxifylline (7,18 mM). Uterine hemodynamics were examined through color and spectral mode ultrasonography on moments: immediately before ovulation induction (approximately 30 hours before AI, T-30), immediately before artificial insemination (TAI) and 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) and 48 (T48) hours after artificial insemination. Samples for endometrial cytology were collected, through cytobrush at T6 moment. Statistical analysis was performed using the analysis of variance (ANOVA), and the range was compared by LSD test, SAS 9.3 version (2010). Pentoxifylline addition did not exert effect on progressive motility, however, pentoxifylline increased path velocity, progressive velocity and curvilinear velocity when compared to controls. There were no significant differences on the percentage of cells presenting intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). No statistical difference was found on uterine blood flow of mares after treatments. However, endometrial cytology showed a major inflammatory response on groups containing Pentoxifylline when compared to controls. In conclusion, pentoxifylline exerted a positive effect on velocity parameters, but do not influence cellular membranes and chromatin. Furthermore, when mares were inseminated with semen containing pentoxifylline, an intense inflammatory response was observed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18112013-161839 |
| Date | 08 August 2013 |
| Creators | Tsunoda, Roberta Harue |
| Contributors | Celeghini, Eneiva Carla Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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