Após o seqüenciamento completo do genoma humano, a busca e caracterização do conjunto completo de genes humanos constitui-se no principal desafio nesta área de investigação, sendo o passo limitante para o progresso na exploração dos dados contidos no seqüenciamento deste genoma. O projeto de transcriptoma denominado \"Transcript Finishing Initiative\" (TFI) surgiu neste contexto, com o objetivo principal de gerar fragmentos parciais de transcritos humanos, que não haviam sido descritos previamente e determinar sua seqüência, para iniciar a caracterização de novos genes humanos. A estratégia utilizada foi q alinhamento de todas as seqüências ORESTES e ESTs disponíveis com a seqüência pública do genoma humano e o agrupamento j c1usterização destas com base nas coordenadas deste genoma. Algumas das regiões que não eram cobertas por estas seqüências foram, então, completadas, por RT-PCR, utilizando-se primers ancorados nos clusters vizinhos. Cada par de clusters de ESTs selecionado para validação experimental foi designado como uma Unidade do \"Transcript Finishing\" (TFU), tendo sido validadas experimentalmente, pelo grupo TFI, Um total de 211 TFUs foram validadas, sendo que 197 seqüências consenso foram submetidas ao Genbank (CF272536-CF272733). Atualmente, apenas um pequeno número destas seqüências ainda são considerados genes novos, sem que haja um cDNA depositado em banco de dados; contudo para um número considerável destas TFUs não existe qualquer caracterização sobre sua função. Na tentativa de contribuir para melhor caracterização dos genes identificados no projeto TFI, e tendo, como base, a linha de pesquisa do laboratório, que busca genes diferencialmente expressos envolvidos em transformação maligna/tumorigênese, o presente trabalho propôs a utilização das seqüências TFUs para estudar sua possível associação com tumores de glia humanos e outros tipos de tumores (de próstata e de mama). Para tanto, as TFUs foram analisadas \"in silico\" para estabelecer seu grau de ineditismo como um novo gene ou um gene sem função conhecida, e, para análise de sua expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais de cérebro, próstata e mama. Para validar estas análises computacionais na bancada, foram gerados macro- e microarranjos de DNA utilizando-se as TFUs disponíveis como clones físicos ou amplicons, para o rastreamento com sondas das linhagens celulares A172 e T98G de glioblastomas. Os resultados das análises destes dados foram confirmados por PCR quantitativo tanto nas linhagens como em amostras clínicas de astrocitomas que apresentam diversos graus de malignidade. Como resultado, foi possível organizar um Banco de Clones Físicos de TFUs, além de identificar e selecionar uma TFU (168), cuja expressão correlaciona diretamente com o grau de malignidade dos tumores de glia. Esta seqüência corresponde a um novo gene, já que não existe a seqüência de cDNA completo nos bancos de dados. Em vista disto, a TFU168 foi selecionada para estudos funcionais posteriores, que já estão em andamento, através da obtenção de suaseqüência completa de cDNA para ensaios de superexpressão e do silenciamento gênico através de RNAi. / Upon complete sequencing of the human genome, identification and characterization of the complete set of human genes constitutes the major challenge in this research field, constituting the limiting step for progress in exploration of the informations contained in the genome sequencing data. The Transcript Finishing Initiative (TFI) transcriptome project arose in this context, aiming at the generation, sequencing and characterization of partial new human transcripts and genes. The strategy adopted was the alignment of the alI the available ORESTES and EST sequences data with the public human genome sequence and their clusterization based on the coordinates of this genome. Thus, some of the regions which were not cover by ESTs and ORESTES (gaps) were then completed by RT-PCR using primers anchored in the neighboring clusters. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was named Transcript Finishing Unit (TFU). A large number (211) of TFU s were validated and 197 -consensus sequences were submitted to the Genbank (CF272536-CF272733). At present, only a few of these sequences are considered as new genes without a full-Iength cDNA sequence deposited in the data bank, however, no functional characterization is yet available for a large number of these sequences. In an attempt to contribute to further characterization of these genes identified in the TFI project and keeping in mind the main interest of our laboratory, which is the identification of differentially expressed genes in tumor versus normal tissue, the present work aims at utilizing these TFUs to find differentially expressed genes associated with human glial tumors and with other kinds of tumors. To this end, these sequences were first subjected to in silico analysis in order to establish their degree of ineditism (new sequences and/or sequences with unknown function) and their expression profile between normal and tumoral tissues of brain, mammary gland and prostate. To validate this computational analysis, DNA macro- and microarrays were generated with the TFU sequences and screened with cDNA probes obtained from the A172 and T98G glioblastomas cell lines. The results of these screenings were confirmed by quantitative PCR both in cell lines and in tumor samples of different degrees of malignancy. The results obtained in this work allowed the organization of a TFUs Physical Clones Bank and the identification and selection of one sequence (TFU 168), whose expression is directly re1ated to the degree of tumor malignancy. This sequence constitutes a new gene, since no complete cDNA sequence is available in the data banks. Therefore, TFU168 was selected for further functional studies by obtaining its full-Iength cDNA sequence to be used for over expression by silencing this gene using RNAi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16112007-111539 |
| Date | 05 October 2007 |
| Creators | Cruz, Luciana Oliveira |
| Contributors | Sogayar, Mari Cleide |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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