A estabilidade genômica é condição essencial à sobrevivência e ao funcionamento dos organismos vivos. No entanto, várias situações podem provocar danos no DNA. Por exemplo, cerca de 104 lesões podem ocorrer no material genético de uma célula de mamífero a cada dia. No intuito de preservar a integridade genômica e contornar os efeitos deletérios destas modificações, uma maquinaria constituída de proteínas especializadas em reconhecer e reparar estes danos foi selecionada ao longo do curso evolutivo. Defeitos em proteínas destas maquinarias causam instabilidade genômica e pode resultar em elevada taxa de mutações e quebras do DNA que resultam em eventos de amplificação gênica, como em células cancerosas. De uma maneira aparentemente contrária ao requerimento de estabilidade genômica como condição primordial para a perpetuação da vida, Leishmania apresenta um genoma notavelmente maleável e explora a amplificação gênica como recurso de sobrevivência. Ainda que a plasticidade genômica em Leishmania seja facilmente demonstrada, nós não conhecemos os mecanismos precisos pelos quais este parasita coordena a ação da maquinaria de detecção de danos no DNA e a consumação dos eventos de amplificação gênica. No intuito de contribuir para a compreensão deste processo, nós identificamos proteínas homólogas do complexo 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1) em Leishmania major. As proteínas LmHus1 e LmRad9 apresentam marcada divergência estrutural em relação aos seus homólogos em outros eucariotos e nenhuma proteína obviamente homóloga a Rad1 foi identificada neste parasita. Análises filogenéticas indicam que LmHus1 e LmRad9 são relacionadas ao complexos heterotriméricos envolvidos na detecção de danos no DNA. Em acordo com isso, nossos experimentos demonstram que alteração nos níveis destas proteínas interfere na capacidade do parasita em lidar com estresse genotóxico. LmHus1 localiza-se no núcleo, é requerida para o crescimento normal deste parasita e a diminuição de sua expressão compromete mecanismos de controle de ciclo celular e manutenção de telômeros. LmRad9 também localiza-se no núcleo e sua superexpressão causa defeito de crescimento e de resposta ao estresse genotóxico em L. major. Nós observamos que LmHus1 e LmRad9 formam um complexo responsivo ao dano no DNA in vivo, uma forte indicação de que o complexo 9-1-1 tenha sido conservado em L. major. As peculiaridades estruturais destas proteínas sugerem que o complexo 9-1-1 de L. major possua uma arquitetura distinta em comparação aos eucariotos superiores. Em adição a isto, outras proteínas, tais como a LmRpa1, também apresentam uma marcante divergência estrutural. Isso sugere que a via de sinalização de danos no DNA envolvendo o complexo 9-1-1 e Rpa1 de L. major possua mecanismos peculiares de ação. Estas observações podem permitir entender como ocorreu o processo evolutivo da sinalização mediada pelo complexo 9-1-1 nos eucariotos, além de ajudar para o entendimento das bases moleculares de como este parasito conduz os eventos de amplificação gênica. / Genome stability is a essential condition for survival and proper functioning of living organisms. However, a broad range of elements may lead to DNA damage. For instance, about 104 DNA lesions may be inflicted upon any given mammalian cell everyday. In order to maintain the genome integrity and circumvent the deleterious effects of these lesions, a molecular machinery composed of proteins specialized in detecting and repairing DNA damage has been selected in evolution. Defects of the proteins that constitute such machineries may result not only in a high mutation rate, but also in breaks in the DNA structure that can mediate gene amplification as observed in cancer cells. In an apparent opposition to such requirement for stability as an essential condition to life, the protozoan Leishmania presents a highly malleable genome and explores genome amplification as a survival and adaptation tool. Despite of the fact that the Leishmania genome plasticity can be easily demonstrated, the precise mechanisms that coordinate the molecular machineries involved in the detection and signaling of DNA damage, and in the regulation of gene amplification is still largely unknown. In order to contribute to a better understanding of these processes, we identified and studied the Leishmania major proteins that are homologues of those proteins that compose the 9-1-1 complex (Rad9-Hus1-Rad1). The proteins LmHus1 and LmRad9 present a high structural divergence when compared to its homologues from other eukaryotes and no obvious homologue of Rad1 was identified in the parasite genome. Phylogeny analysis indicated that LmHus1 and LmRad9 are closely related to heterotrimeric complexes involved in the detection of DNA damage. In accordance to that, our experiments demonstrated that altered levels of these proteins interfere with the parasite ability to deal with genotoxic stress. Moreover, LmHus1 was localized to the parasite nucleus and is a required protein for normal parasite proliferation. Besides, we showed that decreased levels of LmHus1 compromise cell cycle regulation and the maintenance of telomeres. LmRad9 was also shown to be localized to the cell nucleus and its overexpression led to growth defects and affected the L. major response to genotoxic stress. We also observed that LmHus1 and LmRad9 interact with each other to for a protein complex that is responsive to DNA damage in vivo, which strongly suggested that the 9-1-1 complex was conserved in L. major. The structural peculiarities of these proteins indicate that the possible L. major 9-1-1 complex has a different architecture when compared to the complex found in higher eukaryotes. In addition to that, other proteins, such as LmRpa1, also present a marked structural divergence. Altogether, these findings suggest that the DNA damage signaling pathway involving the 9-1-1 complex and LmRpa1 in L. major, may present a peculiar mode of action. These observations may contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by the 9-1-1 complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04042013-114550 |
| Date | 06 February 2013 |
| Creators | Damasceno, Jeziel Dener |
| Contributors | Tosi, Luiz Ricardo Orsini |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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