A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21052014-103120 |
| Date | 05 May 2014 |
| Creators | Strini, Edward José |
| Contributors | Goldman, Maria Helena de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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