O Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Este trabalho teve como objetivo atenuar a forma leveduriforme do P. brasiliensis por irradiação gama para estudos posteriores na pesquisa de vacina. Atualmente não há nenhuma vacina eficaz. As culturas do P.brasiliensis (cepa Pb-18) foram irradiadas com doses entre 0,5 e 8,0kGy. Depois de cada dose os fungos foram plaqueados e após 10 dias as unidades formadoras de colônias (UFC) contadas. A viabilidade das células irradiadas foi avaliada utilizando-se os corantes verde Janus e azul de metileno. A síntese de proteína foi analisada pela incorporação 35S- Metionina. A comparação entre o perfil antigênico das leveduras controle e irradiadas foi feita através do Western blot e a atenuação da virulência foi analisada através da inoculação dessas leveduras em camundongos C57Bl/J6 and Balb/c. Mudanças morfológicas nas leveduras irradiadas foram avaliadas por microscopia eletrônica (transmissão e varredura), e a integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. Na dose de 6,5kGy as leveduras perderam a capacidade reprodutiva. A viabilidade e a incorporação de 35S- Metionina foi similar nos controles e nas células irradiadas com 6,5kGy, mas nesta dose as leveduras secretaram 40% menos proteína. O DNA apresentou-se degradado e esse dano não foi reparado O perfil do Western blot das leveduras controle, foi idêntico aos das leveduras irradiadas com 6,5kGy. Nenhuma UFC foi recuperada dos tecidos dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou significativas alterações no núcleo das células irradiadas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que duas horas após a irradiação as células apresentavam-se
colapsadas e com dobras profundas na superfície das células, entretanto esses danos foram reversíveis. Concluiu-se que para as células leveduriformes do P. brasiliensis foi possível encontrar uma dose na qual o patógeno perdeu sua capacidade reprodutiva e virulência, enquanto reteve sua viabilidade, atividade metabólica e perfil antigênico. / Paracoccidioides brasiliensis is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent mycosis in Latin America, and currently there is no effective vaccine. The aim of this work was to attenuate the yeast form of P. brasiliensis by gamma irradiation for further studies on vaccine research. P. brasiliensis (strain Pb-18) cultures were irradiated at doses between 0.5 and 8.0kGy. After each dose the fungal cells were plated and after 10 days the colony forming units (CFU) counted. The viability of the irradiated cells was measured using the dyes Janus green and methylene blue, and protein synthesis by incorporation of L 35S methionine. The comparison between the antigenic profile of irradiated and control yeast was made by Western blot and the virulence evaluated by the inoculation in C57Bl/J6 and Balb/c mice. Morphological changes in irradiated yeast were evaluated by electronic microscopy and DNA integrity by electrophoresis in agarose gel. At 6.5kGy the yeast lost the reproductive capacity. The viability and the incorporation of L-35S methionine were the same in control and up to 6.5kGy irradiated cells, but 6.5kGy irradiated yeast secreted 40% less proteins. The Western blot profile was clearly similar in control and 6.5kGy irradiated yeast. No CFU could be recovered from the tissues of the mice infected with the radioattenuated yeast. At the dose of 6.5kGy the DNA was degraded and this damage was not repaired. The transmission electronic microscopy showed significant alterations in the nucleus of the irradiated cells. The scanning electronic microscopy showed that two hours after the irradiation the cells were collapsed or presented deep folds in the surface, however these injury were reversible. We concluded that for P. brasiliensis yeastcells it was possible to find a dose in which the pathogen loses its reproductive ability and virulence, while retaining its viability, metabolic activity and the antigenic profile.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.cdtn.br:5 |
| Date | 31 March 2006 |
| Creators | Marina Cortez Demicheli |
| Contributors | Antero Silva Ribeiro de Andrade, Heitor Franco de Andrade Junior, Maria José Neves |
| Publisher | CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, CTRA - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, CDTN, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do CDTN, instname:Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, instacron:CDTN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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