Orientador : Silvio Sanches Veiga / Co-orientador : Waldemiro Gremski / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular Molecular. Defesa: Curitiba, 14/09/2004 / Inclui bibliografia / Resumo: Estudando o extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, detectamos uma atividade lítica sobre moléculas de ácido hialurônico. O extrato de cerdas também foi capaz de degradar condroitim sulfato purificado, porém, incapaz de hidrolisar moléculas de heparam sulfato e dermatam sulfato. Além disso, por meio de ensaios de cinética de degradação de ácido hialurônico, observamos que esta atividade lítica é causada por uma enzima do tipo hidrolase e não do tipo liase. Baseando-se no método colorimétrico descrito por Reissig et al (1955), concluímos que esta hidrolase atua como uma enzima do tipo ß- endohexosaminidase originando resíduos terminais de açúcares Nacetilglucosamina após a lise do ácido hialurônico, ao invés de agir como uma enzima do tipo ß-endoglucuronidase que, por sua vez, gera resíduos de ácido glucurônico. Análises do extrato de cerdas por zimografia resultaram na identificação de moléculas com atividade lítica sobre o ácido hialurônico com
mobilidade eletroforética difusa de 49kDa e 53kDa. Uma avaliação da atividade destas moléculas em função do pH mostrou que estas enzimas não apresentam atividade aparente em pH abaixo de 5,0 e acima de 8,0 e indica que a faixa de pH ótimo para a atividade enzimática está entre 6,0 e 7,0. Por fim, através de reação de fluorescência e análise em microscopia confocal, pudemos comprovar a ação de clivagem do extrato de cerdas sobre o ácido hialurônico organizado na matriz extracelular de derme de coelho. Estes dados nos fornecem evidências experimentais sobre a presença de hialuronidases no extrato de cerdas de L. obliqua, que possivelmente, podem estar envolvidos com os efeitos nocivos desencadeados no envenenamento. Inúmeros constituintes moleculares diferentes têm sido estudados a partir dos produtos de secreção da lagarta L. obliqua e entre eles se destacam as serinoproteases com atividade pró-coagulante e/ou fibrinogenolítica. Com base nestes dados, consideramos a hipótese de identificar e caracterizar um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta com possível função de proteção contra suas próprias toxinas, ou mesmo, com função tóxica durante os acidentes. Experimentos utilizando fibronectina como substrato protéico para diferentes proteases (tripsina, elastase, quimiotripsina, proteinase K, papaína, pepsina e colagenase V) foram realizados na presença de hemolinfa. O perfil de degradação da fibronectina foi avaliado por ensaios de Western Blotting utilizando anticorpos que reconhecem fibronectina. A atividade proteolítica da tripsina, elastase, quimiotripsina e proteinase K foi inibida pela hemolinfa da lagarta. Esta atividade inibitória detectada foi avaliada sob diferentes temperaturas de incubação, mostrando que o inibidor de protease presente na hemolinfa é funcional a 4, 20, e 37°C. Além disso, experimentos adicionais mostraram que esta atividade inibitória da hemolinfa também ocorre
quando tripsina é incubada com diferentes substratos protéicos (fibrinogênio, laminina e vitronectina). Com o intuito de purificar a molécula do inibidor de protease, alíquotas de hemolinfa bruta de L. obliqua foram submetidas a ensaios de cromatografia de gel filtração utilizando resina Sephadex G-100 seguidos de ensaios de cromatografia de afinidade utilizando resina tripsinaagarose. As frações eluídas das cromatografias foram monitoradas para a presença de proteínas por absorbância em 280nm e submetidas à incubação com fibronectina e tripsina para detecção da atividade inibitória observada por SDS-PAGE 7,5%. Para fortalecer este resultado foi realizado um zimograma reverso, utilizando gelatina como substrato, em que as frações com atividade inibitória foram avaliadas. Sob estas condições, identificamos um inibidor de
serinoprotease na hemolinfa da lagarta L. obliqua com mobilidade eletroforética na região de 21kDa. Com o objetivo de avaliar o grau de reversibilidade da inibição da atividade proteolítica pela ação do inibidor de protease, alíquotas de tripsina pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia foram submetidas a experimentos de zimograma com gelatina impregnada. Com isso pudemos observar que a interação inibidor-protease é resistente ao SDS e à eletroforese gerando alteração na mobilidade da tripsina mas não inativando irreversivelmente a sua atividade. Especulando sobre uma futura aplicação biotecnológica deste inibidor, realizamos um experimento, para avaliarmos a possível inibição da ação da molécula de trombina quando na presença de fibrinogênio em solução, em que trombina foi pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia de gel filtração e depois adicionada à uma solução de fibrinogênio. Pudemos observar que, respeitando uma característica importante dos inibidores de protease que possuem aplicações no campo terapêutico, o inibidor de serinoprotease da hemolinfa da lagarta L. obliqua não foi capaz de inibir a atividade da trombina, uma importante enzima da cascata
de coagulação / Abstract: By studying Lonomia obliqua (caterpillar) bristles extract we were able to detect a lytic activity on purified hyaluronic acid. Also, the bristle extract hydrolyses purified chondroitin sulphate, but was unable to degrade either heparan sulphate or dermatan sulphate. Moreover, through purified hyaluronic acid-degrading kinetic assays, we observed that this lytic activity was caused by a hydrolase instead a lyase enzyme. In addition, by using the colorimetric reaction of Reissig (1955), we detected this hyaluronic acid hydrolase action as a ß-endohexosaminidase enzyme originating terminal N-acetylglucosamine residues instead a â-endoglucuronidase that might originate glucuronic acid residues. Zymogram analysis of the bristle extract detected 49kDa and 53kDa molecules with hyaluronic acid lytic activity. An examination of these hyaluronic acid degrading activities as function of pH showed that these hydrolases had no apparent activities at pH below 5.0 and higher than 8.0 and displayed their optimal activities at pH ranging from 6.0 to 7.0. Finally, through a fluorescence reaction to hyaluronic acid and confocal microscopy, we further comproved this cleaving action upon hyaluronic acid organised on the extracellular matrix of the rabbit dermis. The data provide experimental evidence of the presence of hyaluronidases in the L. obliqua bristle extract, probably involved on the harmful effects of the venom. Several different molecular constituents have been described in L. obliqua secretion products and among them serineproteases with procoagulant and fibrinogenolytic activity were identified in its bristles. Based on these results, we have considered the hypothesis of identifying a serineprotease inhibitor in caterpillar haemolymph with possible self defense function against their own toxins or even deleterious activities during accidents. Experiments using fibronectin as a protein substrate for different proteases such as trypsin, elastase, chymotrypsin, proteinase K, papain, pepsin and collagenase V were performed in the presence and absence of haemolymph. Fibronectin degradation profile was evaluated by Western Blotting assays using antibodies that recognize fibronectin. The proteolytic activities of trypsin, elastase, chymotrypsin and proteinase K were inhibited by incubation with L. obliqua haemolymph. This inhibitory activity was also evaluated at different temperatures showing that the inhibitor is functional at 4, 20, and 37°C. In addition, experiments showed that this inhibitory activity also occurs when trypsin was incubated with different substrates such as fibrinogen, laminin and vitronectin molecules. With the goal of purify the inhibitor molecule, haemolymph was submitted to a Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by an affinity chromatography using trypsin-agarose. Eluted fractions were monitored for the presence of proteins by absorbance at 280nm and were submitted to incubation with fibronectin and trypsin for detection of inhibitory activity that was observed by SDS-PAGE 7,5%. To ensure this result, a reverse zymography of the fractions with activity was performed using gelatin as substrate. Under these conditions, we were able to identify a trypsin inhibitor with a diffuse eletrophoretic mobility apparently at 21kDa region in L. obliqua haemolymph. Next, we studied the mechanism by which haemolymph serine protease inhibitor inactivates proteases. Trypsin was incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and then electrophoresed by using a SDS-PAGE (experimental procedure that is able to separate protease from protease inhibitor in case of reversible inhibition), followed by a gelatin-zymogram. This assay suggest that protease inhibitor interaction with trypsin was resitent to SDS and electrophoretic separation conditions, altered trypsin mobility but did not inactivate its proteolytic activities in a unreversible manner. Then, speculating about the biotechnological applications of this protease inhibitor, we evaluated the ability of this molecule inhibit the thrombin activity upon fibrinogen. Aliquots of thrombin were pre-incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and, then, incubated with fibrinogen solution. This result showed that the haemolymph serine protease inhibitor is unable to block fibrinogen-thrombin dependent clotting in vitro, as well as waited for all protease inhibitors use.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/681 |
| Date | January 2004 |
| Creators | Gouveia, Ana Isabel da Costa Bernuci |
| Contributors | Veiga, Silvio Sanches, 1962-, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica, Gremski, Waldemiro, 1945- |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 110f. : il. color., grafs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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