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Previous issue date: 2016-09-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lectinas estão envolvidas em uma ampla variedade de processos biológicos, inclusive atuando como agentes imunomoduladores capazes de ativar a imunidade inata. Nós purificamos e caracterizamos uma nova lectina de couve-flor (Brassica oleracea ssp. botrytis – BOL) através de três etapas sequenciais de cromatografia, cuja pureza foi confirmada por SDS-PAGE. Além disso, avaliamos o papel dessa lectina na imunidade inata por meio de um ensaio de fagocitose, produção de H 2 O 2 e NO. BOL foi caracterizada como uma proteína não glicosilada com uma massa molecular de ~ 34 kDa em SDS-PAGE. Para otimizar o processo de obtenção da lectina e possibilitar um estudo mais aprofundado de sua estrutura e função, realizou-se a clonagem molecular e expressão heteróloga de BOL. Para isso utilizamos RNA total extraído de plântulas de couve-flor e isolamos a sequência de 1053 pb do cDNA codificante. Ferramentas de bioinformática foram utilizadas para determinar a sequência promotora de 1000 pb de Bol, a qual revelou vários elementos cis-regulatórios conhecidos por estarem envolvidos em várias condições de estresse na planta. A análise comparativa tecido-específica da expressão de Bol demonstrou níveis mais elevados do transcrito nas folhas, em comparação aos tecidos do caule e da raiz. A análise da sequência de aminoácidos e o alinhamento com proteínas homólogas deduzidas nos permitiu determinar que a proteína madura é constituída por 301 aminoácidos. A estrutura tridimensional predita confirmou que esta lectina apresenta uma estrutura em forma de cúpula com dois domínios MATH. Este é o primeiro relato do isolamento, clonagem e expressão bacteriana de uma lectina com domínios MATH e pode ser de interesse significativo para compreender o papel regulador desta proteína como agente imunoestimulante bem como para à fisiologia da própria planta. / Lectins are involved in a wide range of biological mechanisms, including act as immunomodulatory agent able to activate the innate immunity. We purified and characterized a new lectin from cauliflower (Brassica oleracea ssp. botrytis - BOL) by three sequential chromatographic steps and confirmed the purity by SDS-PAGE. Additionally, we evaluated the role of the lectin in innate immunity by a phagocytosis assay, production of H 2 O 2 and NO. BOL was characterized as a non-glycosylated protein with a molecular mass of ~34 kDa in SDS-PAGE. To optimize the process of the lectin obtaining and allow further study of their structure and function, the molecular cloning and heterologous expression of BOL were carried out. Using total RNA extracted from cauliflower seedlings a Bol coding cDNA sequence of 1053 bp was isolated. Bioinformatics tools were used to determine a promoter sequence of 1000 bp of Bol which revealed several key cis-regulatory elements known to be involved in various plant stresses. Comparative expression analysis of tissue specific Bol demonstrated the highest transcript levels in leaves, as compared to stem and root tissues. Analysis of amino acid sequence and alignment with deduced homologous proteins allowed us to determine that the mature protein comprises 301 amino acids. Predicted three-dimensional structure confirmed that this lectin had an overall dome-like structure with two MATH-domains. This is the first report of isolation, cloning and bacterial expression of a lectin with MATH-domains and may be of significant interest to understand the regulatory role of this protein as immunostimulatory agent as well as to the physiology of the plant itself.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/9366 |
| Date | 16 September 2016 |
| Creators | Duarte, Christiane Eliza Motta |
| Contributors | Paula, Sérgio Oliveira de, Koehler, Andréa Dias, Oliveira, Leandro Licursi de |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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