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Previous issue date: 2006-07-11 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / The main objective of this work was to isolate the ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504
(sodB1) of C. violaceum and induce their expression in Escherichia coli cells harboring sod
genes, to evaluate the increase in SOD activity in the recombinant cells exposed to oxidative
stress conditions. The sodB1 gene was isolated by PCR, using specific primers, and cloned
into pGEM ® -T Easy vector. The amplification reaction could not be optimized for the second
set of primers, specific for sodB2 gene. In an attempt to obtain a vector suitable for the
regulated heterologous expression of SOD, some strategies were proposed for the
construction of vectors with expression under the control of a sterically repressed promoter –
srp. The sodB1 gene was then subcloned into vectors pCR4-SRP and pUC-SRP, derived from
pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectively, both developed during this project. However, the
obtaining of recombinant clones was not possible. Despite the fact that SOD is not a toxic
protein for the cell, we tested the hypothesis of the lethality of recombinant clones caused by
the overexpression of SOD. Thus, amy and pfu genes were cloned into pUC-SRP, although
the clones harboring the gene of interest could not be obtained. We concluded that the
expression mechanisms of pUC-SRP and pCR4-SRP vectors may have caused deletery
effects to the host cells, and that modifications in their structure should be made for the
minimizing of heterologous expression levels, reducing the risk of toxicity for the clones. / O principal objetivo do trabalho foi isolar as regiões estruturais dos genes sod
correspondentes às ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) de C. violaceum e expressá-
las em células de Escherichia coli portando os genes sod, para avaliar o incremento da
atividade de SOD nas células recombinantes submetidas a condições de estresse oxidativo. O
gene sodB1 foi isolado via PCR, utilizando iniciadores específicos, e clonado em vetor
pGEM ® -T Easy. Para sodB2, não conseguiu-se otimizar a reação de amplificação. Com o
intuito de obter um vetor para expressão heteróloga regulada de SOD foram traçadas
estratégias para a construção de vetores com expressão controlada por um promotor
estericamente regulado - srp. O gene sodB1 foi então subclonado nos vetores pCR4-SRP e
pUC-SRP, derivados de pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectivamente, ambos desenvolvidos a
partir deste trabalho. No entanto, não foi possível a obtenção de clones recombinantes.
Apesar de SOD não ser uma proteína tóxica para a célula, testou-se a hipótese de que a
superexpressão desta proteína seria a causa da letalidade dos clones recombinantes. Assim,
foram clonados os genes amy e pfu em pUC-SRP. Porém, mais uma vez não foram obtidos
clones portando os genes de interesse. Conclui-se então que os mecanismos de expressão do
vetor pUC-SRP, bem como de pCR4-SRP, devem ter ocasionado efeitos deletérios às células
hospedeiras, e que alterações na sua estrutura devem ser feitas no sentido de minimizar os
níveis de expressão heteróloga, reduzindo assim o risco de produção de toxicidade para os
clones.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:tede/2098 |
| Date | 11 July 2006 |
| Creators | Dutra, Daniel Lúcio Rodrigues |
| Contributors | Astolfi, Filho, Spartaco, Andrade, Edmar Vaz de |
| Publisher | Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEv), INPA, Brasil, Coordenação de Pós Graduação (COPG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do INPA, instname:Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, instacron:INPA |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -5829914500254207356, 600, 600, 600, 600, 3806999977129213183, -5518144268585252051, -4671505905809893211 |
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