Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2016-02-11T17:48:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Daniel Lúcio Rodrigues Dutra.pdf: 623819 bytes, checksum: e27c559cf8e657f3868f5417b83e9c4d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-11T17:48:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Daniel Lúcio Rodrigues Dutra.pdf: 623819 bytes, checksum: e27c559cf8e657f3868f5417b83e9c4d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2006-07-11 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / The main objective of this work was to isolate the ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) of C. violaceum and induce their expression in Escherichia coli cells harboring sod genes, to evaluate the increase in SOD activity in the recombinant cells exposed to oxidative stress conditions. The sodB1 gene was isolated by PCR, using specific primers, and cloned into pGEM ® -T Easy vector. The amplification reaction could not be optimized for the second set of primers, specific for sodB2 gene. In an attempt to obtain a vector suitable for the regulated heterologous expression of SOD, some strategies were proposed for the construction of vectors with expression under the control of a sterically repressed promoter – srp. The sodB1 gene was then subcloned into vectors pCR4-SRP and pUC-SRP, derived from pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectively, both developed during this project. However, the obtaining of recombinant clones was not possible. Despite the fact that SOD is not a toxic protein for the cell, we tested the hypothesis of the lethality of recombinant clones caused by the overexpression of SOD. Thus, amy and pfu genes were cloned into pUC-SRP, although the clones harboring the gene of interest could not be obtained. We concluded that the expression mechanisms of pUC-SRP and pCR4-SRP vectors may have caused deletery effects to the host cells, and that modifications in their structure should be made for the minimizing of heterologous expression levels, reducing the risk of toxicity for the clones. / O principal objetivo do trabalho foi isolar as regiões estruturais dos genes sod correspondentes às ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) de C. violaceum e expressá- las em células de Escherichia coli portando os genes sod, para avaliar o incremento da atividade de SOD nas células recombinantes submetidas a condições de estresse oxidativo. O gene sodB1 foi isolado via PCR, utilizando iniciadores específicos, e clonado em vetor pGEM ® -T Easy. Para sodB2, não conseguiu-se otimizar a reação de amplificação. Com o intuito de obter um vetor para expressão heteróloga regulada de SOD foram traçadas estratégias para a construção de vetores com expressão controlada por um promotor estericamente regulado - srp. O gene sodB1 foi então subclonado nos vetores pCR4-SRP e pUC-SRP, derivados de pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectivamente, ambos desenvolvidos a partir deste trabalho. No entanto, não foi possível a obtenção de clones recombinantes. Apesar de SOD não ser uma proteína tóxica para a célula, testou-se a hipótese de que a superexpressão desta proteína seria a causa da letalidade dos clones recombinantes. Assim, foram clonados os genes amy e pfu em pUC-SRP. Porém, mais uma vez não foram obtidos clones portando os genes de interesse. Conclui-se então que os mecanismos de expressão do vetor pUC-SRP, bem como de pCR4-SRP, devem ter ocasionado efeitos deletérios às células hospedeiras, e que alterações na sua estrutura devem ser feitas no sentido de minimizar os níveis de expressão heteróloga, reduzindo assim o risco de produção de toxicidade para os clones.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:39:39Z No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:39:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:40:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T12:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) Previous issue date: 2015-09-26 / According to the World Health Organization (WHO), diabetes mellitus is expected to reach 333 million by 2025 and around 2030 is going to be the second cause of death in Latin America. Therefore, an insulin production increasing becomes a need to meet future market demands. The heterologous expression system in Pichia pastoris have been increasingly used and has proven to be an attractive alternative for over expressing human genes for biotechnological purposes. Thus, this work has as main objective to produce human proinsulin by P. pastoris using a PGK gene promoter. A1 gene codes for the insulin precursor and was chemically synthesized with optimized codons for P. pastoris. This gene was cloned into expression vector / secretion under control of PGK P. pastoris promoter and integrated into the genome of P. pastoris GS115. Transformant clones were selected for increased zeocin production and from dot-blotting. The production of recombinant proinsulin was performed in YPD liquid in shake flasks at 30 ° C, 180 rpm. The supernatant was clarified by centrifugation, and detection of recombinant proteins by ELISA, electrophoresis in denaturing polyacrylamide gel, Western-blotting and finally chromatography for size exclusion. Best conditions for expression / secretion of proinsulin were established through statistical experimental design detecting the expression level by ELISA. The amount of pre-proinsulin mRNA was determined from two samples of two contrasting conditions of A140 clone with the highest and lowest production of proinsulin using Real-Time PCR (qPCR). As results, the recombinant clones that had higher resistance to Zeocin also showed more intense positive signs in the dot-blotting. Proinsulin coding sequence (A1) was efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the cell culture supernatant, with molecular weight of approximately 7.5 kDa. The A140 clone showed significant productivity in production level within 48 to 72 hours after the improvement of the YPD culture medium showed level of 0.83 g/L of insulin expression at 72 hours, for total biomass of about 50g / L. High levels of proinsulin expression with PGK promoter using P. pastoris as host make this heterologous expression attractive for human proinsulin production as well as other industrial proteins. / De acordo com os indicadores da Organização Mundial de Saúde (OMS) o diabetes mellitus deve alcançar 333 milhões de pessoas em 2025 no mundo e em 2030 na América Latina será a segunda causa de morte, por isso o aumento da produção de insulina torna-se uma necessidade para suprir as futuras demandas de mercado. Os sistemas de expressão em leveduras tipo Pichia pastoris tem sido cada vez mais utilizados e tem-se mostrado como atraentes alternativas para a expressão de proteínas para fins industriais. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo principal a produção de proinsulina humana por Pichia pastoris utilizando o promotor do gene PGK. O gene A1 que codifica o precursor da insulina foi sintetizado quimicamente com codóns otimizados para a expressão em P. pastoris. Esse gene foi clonado em vetor de expressão/secreção sob controle do promotor PGK de P. pastoris e integrado no genoma de P. pastoris GS115. A produção de proinsulina recombinante foi realizada em meio líquido YPD em frascos agitados a 30°C, a 180 rpm. A análise da proinsulina expressa em P. pastoris foi realizada por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e Western-blotting e mostrou massa molecular de aproximadamente 7,5 kDa. O clone recombinante A140 que apresentou maior resistência a zeocina e sinal positivo mais intenso no imunodot-blotting foi utilizado para estabelecer condições melhores de expressão/secreção de proinsulina em planejamento fatorial estatístico experimental. As condições de cultivo que se mostraram melhores para a produção da proinsulina foram: composição do meio de cultivo (dextrose 7,5%, extrato de levedura 1% e peptona 0,15%), temperatura de 25°C e pH do meio igual a 7,0. O clone A140 nas melhores condições de cultivo atingiu biomassa total de 50g/L e nível de expressão de insulina de 0,83g/L em 72 horas de cultivo. A expressão de proinsulina em altos níveis utilizando o promotor PGK em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção da proinsulina humana e outras proteínas de interesse industrial.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-04T18:15:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarceloCordeiro.pdf: 2495604 bytes, checksum: 2d51566d7f95818c5bd7b1860032afdc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T18:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarceloCordeiro.pdf: 2495604 bytes, checksum: 2d51566d7f95818c5bd7b1860032afdc (MD5) Previous issue date: 2010-09-27 / Os papilomavírus são um grupo de pequenos vírus DNA dupla fita caracterizado por induzir a formação de lesões que, normalmente, são benignas e podem regredir naturalmente, mas também apresentam opotencial para se tornarem tumores malignos. O papilomavírus humano (HPV) está fortemente relacionado às doenças sexualmente transmissíveis (DST) e é uma das principais causas de câncer cervical. O papilomavírus bovino (BPV), por sua vez, representa um grave problema econômico em termos de pecuária. Em bovinos, são mais comuns as papilomatosescutânease mucosas nas regiões genital e orofaríngea. Existem bem caracterizados seis tipos diferentes de BPV (BPV 1 ao 6) e, recentemente, quatro novos tipos (BPVs 7 ao 10) foram seqüenciados. No Nordeste, especialmente no estado de Pernambuco (Zona da Mata), a incidência da papilomatose bovina é muito alta, causando grandes perdas econômicas para os criadores. Não há tratamento com eficácia comprovada. Proteção contra a infecção é conferida por anticorpos neutralizantes dirigidos contra osepítopos conformacionais de proteínas estruturais L1. Esses anticorpos podem ser eficientemente induzidos pela imunização com virus-like particles(VLP) que se formam espontaneamente, após a expressão de L1 em sistemas heterólogos. Nos últimos anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema eficaz e barato para produzir altos níveis deproteínarecombinante. O foco deste trabalho foi construir e avaliar dois plasmídeos (pPICZAαL1B2 e pPICZAL1B2), como vetores para expressão do geneL1BPV-2 em células de P. pastoris. Um deles (pPICZAαL1B2) insere na proteína recombinante um sinal de secreção (α-mating). Assim, esperou-se comparar a eficiência da expressão heteróloga através das viasintra e extracelulares. O gene L1 foi amplificado por PCR do genoma completo BPV-2, foi clonado em vetor pGEM-T(Promega ®) e, posteriormente, foi subclonado nos vetores de expressão pPICZA e pPICZAα (Invitrogen ®). PCR e análise de restrição indicarama inserção correta do gene L1 em ambos os vetores, bem como o seqüenciamento. Por eletroporação, P. pastoris (cepa de levedura X-33) foi transformada com a construção pPICZAL1B2 ou pPICZAαL1B2, cuja integração no genoma de levedura pode ser identificada por PCR da colônia. As leveduras transformadas foram selecionadas para experimentos de cultura com indução com metanol. A expressão de L1 foi indicada por RT-PCR e análise de proteínas. A proteína recombinante L1foi detectada em células de levedura, que sofreram tratamento com solução de lise (via intracelular) e em meio de cultura submetido a precipitação com acetona (via extracelular). Este estudo fornece um caminho para uma estratégia de vacina com VLP contra papilomaviroses bovina e apresenta um modelo experimental para estudos de papilomatosessimilares, além de mostrar um modelo experimental interessante para futuras aplicações em seres humanos. / Papillomaviruses are a group ofsmall double-stranded DNA viruses characterized by inducingthe formation of lesions that are usually benign and may regress naturally, but also havethe potential to become malignant tumors. The human papillomavirus (HPV) is strongly related to sexually transmitted diseases (STDs) and is a major cause of cervical cancer. The bovine papillomavirus (BPV), in turn, represents a serious economic problem in terms of livestock. In cattle,cutaneous and mucosal papillomatosis at genital and oropharyngeal regionsare the most common. There are six different types of BPV (BPV 1-6) well characterized and, recently, four new types (BPVs 7-10) havebeen sequenced.In theNortheast, especially inthe state of Pernambuco (Zona da Mata), the incidence of bovine papillomatosis isveryhigh,causing great economic losses for breeders. There isno treatment with proven efficacy. Protection against infection is conferred by neutralizing antibodies directed against structural L1proteinconformational epitopes. These antibodies can be efficiently induced by immunization with virus-like particles (VLP) that are formed spontaneously after L1 expression in heterologous systems. In recent years, the methylotrophic yeast Pichia pastorishas emerged as an efficient and inexpensive heterologous system to produce high protein levels. The focus of this paper is to construct andevaluate two plasmids (pPICZAαL1B2 and pPICZAL1B2), as vectors to gene expression of L1BPV-2 in cells of P. pastoris. One of them (pPICZAαL1B2) inserts a secretion signal (α-matting)on recombinant protein. Thus, it had been expected to compare the heterologous expression via intracellular and extracellular pathway efficiency. L1 gene has been amplified by PCR from the complete BPV-2 genome, has been cloned into pGEM-T vector (Promega®) and, subsequently, has been sub cloned into pPICZA and pPICZAαexpression vectors (Invitrogen®). PCR and restriction analysis haveindicated the correct insertion of the L1 gene in both vectors, as well as sequencing. By electroporation, P. pastoris(strain X-33 yeast) has been transformed with pPICZAL1B2 orpPICZAαL1B2 constructions, whose integration into yeast genome could be identified by colony PCR. Transformed yeast has been selected to culture experiments withmethanol induction. L1 expression has been indicated by RT-PCR and protein analysis. L1 recombinant protein has been detected in yeast cells that has undergonelysis solution treatment (intracellular pathway) and from the culture medium acetone precipitation submitted (extracellularpathway). This study provides a way for a VLP-vaccine strategyagainst bovine papillomaviroses and exhibits an experimental model for similar papillomatosis studies, whileshowingan interesting experimental model for future applications in humans.