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Previous issue date: 2018-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Dengue and zika are viral infectious diseases occurring in countries with a tropical
and subtropical climate in which around 3.6 billion people live. It is estimated that in
50 to 100 million new cases of dengue occur annually, generating economic, social
and public health impacts. Dengue and zika have usually been diagnosed by
serological methods which are generally of low confidence, as they can generate
false-positive results, which are related to the presence of antibodies produced
against previous infections of the virus. The molecular methods are more accurate,
however the molecular method most commonly used (PCR) requires a long time of
reaction and requires sophisticated instrumentation and high cost, making point of
care applications difficult,, especially in developing countries. This work presents the
development of a molecular diagnostic methodology in a paper-based platform that
allowed the detection of the virus through the reverse transcription -loop mediated
isothermal amplification (RT-LAMP). The reactions were carried out on 6 mm
diameter FTA paper discs, confined in a multi-layered polyester-toner device,
incubated at 65 ° C for 45 minutes in a dry bath and then performed visual detection
using the SYBR Green intercalator. Positive reactions were identified by the green
fluorescence emitted after the addition of the intercalator. The results were recorded
through the capture of the images by a photodocumentator and/or by smartphone and
later analyzed by the software ImageJ, allowing the comparison between negative
and positive reactions. The methodology developed for the detection of the virus by
RT-LAMP in paper substrate was sensitive, being able to detect the virus in initial
concentrations of 0.1 pg μL
-1
of RNA in the master mixture. In addition, it was
possible to detect the virus directly in complex samples (serum of infected patients)
without the need of previous viral RNA extraction step. Elimination of the RNA
extraction step together with the visual detection on the paper produce the final result
in 46 minutes. The results demonstrated that the detection of the virus by RT-LAMP
in paper substrates is a valuable tool for the molecular diagnosis of infectious
diseases, presenting great potential for point-of-care applications for both diagnostics
and epidemiological studies, especially in developing countries. / A dengue e a zika são doenças infecciosas virais de ocorrência nos países de clima
tropical e subtropical no qual vivem cerca de 3,6 bilhões de pessoas, estimando-se,
no caso da dengue, que 50 a 100 milhões de novos casos da doença ocorram
anualmente, gerando impactos econômicos, sociais e de saúde pública. A dengue e a
zika têm sido usualmente diagnosticadas por métodos sorológicos que são em geral
de baixa confiança, pois podem gerar resultados falso-positivos, que estão
relacionados à presença de anticorpos produzidos contra infecções anteriores do
vírus. Os métodos moleculares são mais precisos, porém o método molecular mais
utilizado atualmente (PCR) requer longo tempo de realização e necessita de
instrumentação sofisticada e de alto custo, dificultando sua aplicação no ponto de
atendimento, especialmente em países em desenvolvimento. Este trabalho apresenta
o desenvolvimento de uma metodologia de diagnóstico molecular em uma
plataforma a base de papel que permitiu a detecção do vírus por meio da reação de
transcrição reversa seguida pela amplificação isotérmica mediada por loop (RTLAMP).
As reações foram realizadas em discos de papel FTA com 6 mm de
diâmetro, confinado em dispositivo multicamadas de poliéster-toner, incubados à 65
°C por 45 minutos em banho seco e posteriormente realizado a detecção visual onchip,
através da utilização do intercalador SYBR Green. As reações positivas foram
identificadas pela fluorescência verde emitida após a adição do intercalador. Os
resultados foram registrados por meio da captura das imagens por uma
fotodocumentadora e/ou por câmera de celular e posteriormente analisados pelo
software ImageJ, permitindo a comparação entre reações negativas e positivas. A
metodologia desenvolvida para a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de
papel apresentou-se sensível, sendo capaz de detectar o vírus em concentrações
iniciais de 0,1 pg µL-1
de RNA na mistura reacional. Além disso, foi possível detectar
o vírus diretamente em amostras complexas (soro de pacientes infectados) sem a
necessidade da etapa prévia de extração do RNA viral. A eliminação da etapa de
extração do RNA juntamente com a realização da detecção visual no próprio papel
proporcionou a obtenção do resultado final em 46 minutos. Os resultados
demonstraram que a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de papel é uma
importante ferramenta para o diagnóstico molecular de doenças infecciosas,
apresentando grande potencial para aplicações no ponto de atendimento tanto para
diagnósticos quanto para estudos epidemiológicos, especialmente em países em
desenvolvimento.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/8551 |
| Date | 13 April 2018 |
| Creators | Fé, Thiago Henrique Moreira da |
| Contributors | Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes, Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes, Bailão, Alexandre Melo, Chaves, Andréa Rodrigues |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Química (IQ), UFG, Brasil, Instituto de Química - IQ (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 663693921325415158, 600, 600, 600, 600, 7826066743741197278, 1571700325303117195, 2075167498588264571 |
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