Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

Resumo: Os herpesvírus humanos podem estar relacionados a encefalites, meningites e outras doenças neurológicas. No Brasil, as infecções virais estão entre as principais causas de internamentos hospitalares. Este trabalho tem como objetivos padronizar e comparar as metodologias de diagnóstico dos vírus da família Herpesviridae por nested PCR e PCR seguida por digestão com enzimas de restrição; descrever características clínicas e epidemiológicas de pacientes com encefalites, meningoencefalites e mielites causadas por vírus da família Herpesviridae, diagnosticados pela metodologia da PCR no laboratório de virologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (HC-UFPR) e comparar as características clínicas e laboratoriais dos diferentes grupos de pacientes (imunocomprometidos e imunocompetentes; com encefalites e meningoencefalites). As amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) foram obtidas de pacientes com suspeita de meningites e meningoencefalites, de 2005 a 2008. Os vírus da família Herpesviridae estudados foram: herpes simplex vírus tipo 1 (HSV-1) herpes simplex vírus tipo 2 (HSV-2), varicela zoster vírus (VZV), citomegalovírus (CMV), epstein-barr vírus (EBV) e herpesvírus humano 6 (HHV-6). Dados clínicos e epidemiológicos foram obtidos a partir de prontuários médicos. As amostras foram submetidas a análises bioquímicas e citológicas. A metodologia que apresentou maior positividade foi a de nested PCR (19%). Um total de 46 amostras pertencentes a 45 pacientes foram positivas para um ou mais vírus. Prontuários médicos de 42 pacientes foram revisados. Os pacientes foram divididos em dois grupos: Grupo I, imunocompetentes 40,00% (18/45), e Grupo II, imunocomprometidos 47,00% (21/45), e também classificados em pacientes com encefalites, 57,50% (23/40), e meningoencefalites, 40,00% (16/40). No grupo I, a média de idade foi de 25,00 ± 21,60 anos, mediana de 19,00 anos (variação interquartil 25-75 de 8,50 a 42,00 anos), sendo 38,80% do sexo masculino. HHV-6 foi identificado em 33,00%, EBV 28,00%, HSV 11,00%, VZV 11,00%, enterovírus/EBV 11,00% e CMV 5,50% das amostras do grupo I. No grupo II, a média de idade foi de 35,10 + 15,00 anos e mediana de 35,00 anos (variação interquartil 25-75 de 29,50 a 32,50 anos), sendo 66,66% do sexo masculino. EBV foi identificado em 36,00%, HSV em 32,00%, CMV em 18,20%, HHV-6 em 4,50%, HHV-6/CMV em 4,50% e CMV/HSV em 4,50% das amostras do grupo II. Em quatro amostras de ambos os grupos (9%, 4/46), foi identificado mais de um vírus no mesmo material. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais dos pacientes com infecção neurológica por herpesvírus. O EBV foi o mais frequente em amostras de LCR no grupo dos imunocomprometidos (36,00%), enquanto no grupo dos imunocompetentes, o HHV-6 (33,00%) foi o patógeno mais comumente encontrado.

Os métodos convencionais para o diagnóstico da tuberculose (TB) pleural possuem várias limitações, assim métodos mais sensíveis e específicos são necessários. O objetivo deste estudo foi avaliar uma metodologia de hibridização em microplaca e uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis em amostras de líquido pleural, fragmento de pleura e soro. Adicionalmente, foi avaliada a utilidade da PCR em tempo real em paralelo com a cultura do líquido pleural para o diagnóstico de TB pleural. Foram avaliados 161 pacientes com derrame pleural e submetidos à toracocentese e biópsia pleural. O padrão-ouro para definição de um caso de TB pleural baseou-se na combinação de baciloscopia, cultura, exame histopatológico e critérios clínicos. Cento e sete dos 161 pacientes com derrame pleural receberam diagnóstico de TB pleural. Os resultados da metodologia de hibridização em microplaca não foram satisfatórios, assim foi desenvolvida uma técnica de PCR em tempo real. Nas amostras de líquido pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 46% (IC 95%, 36%-56%) com especificidade de 100%, enquanto a cultura obteve uma sensibilidade de 29% (IC 95%, 20%- 38%). A PCR em tempo real realizada em associação com a cultura no líquido pleural apresentou uma sensibilidade de 60% (IC 95%, 50%-70%). Para as amostras de fragmento pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 42% (IC 95%, 26%-59%) e especificidade de 100%, para este tipo de amostra o exame histopatológico apresentou a maior sensibilidade (90% - IC 95%, 84%- 96%). Nas amostras de soro a PCR em tempo real foi positiva em apenas dois pacientes, os quais também apresentaram resultado positivo nos outros tipos de amostras. Estes resultados indicam que a PCR em tempo real realizada no líquido pleural pode ser uma forma útil para obter um diagnóstico de TB pleural mais rápido, específico e com um procedimento menos invasivo para coleta das amostras. / Conventional tests for pleural tuberculosis (TB) have several limitations and more sensitive and specific methods are needed. The aim of this study was to evaluate microwell hybridization and real-time PCR (polimerase chain reaction) for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in pleural fluid, pleural tissue and serum. Additionally, the utility of real-time PCR in parallel with culture in pleural fluid for the diagnosis of pleural TB was assessed. One hundred sixty one patients with a pleural effusion submitted to a thoracentesis and pleural biopsy were evaluated. The gold-standard for case definition of pleural TB were the combination of acid-fast bacilli, culture, histopathologic examination and clinical parameters. One hundred seven of the 161 patients with pleural effusion received diagnosis of pleural TB. Results of microwell hybridization were not satisfactory, thus we developed a real-time PCR assay. In pleural fluid specimens, real-time PCR showed a sensitivity of 46% (CI 95%, 36%-56%) with specificity of 100%, while the sensitivity of culture was 29% (CI 95%, 20%-38%). The combination of real time PCR and culture in pleural fluid showed a sensitivity of 60% (CI 95%, 50%-70%). For the pleural tissue, real-time PCR showed a sensitivity of 42% (CI 95%, 26%-59%) with specificity of 100%, for this specimen histopathologic examination had the highest sensitivity (90% - CI 95%, 84%-96%). In the serum real-time PCR was positive in only two patients, which also had positive results in other specimens. Our results indicate that the real-time PCR is a useful approach to achieve a more rapid and specific diagnosis for pleural TB with a less invasive procedure for specimen collection.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente da síndrome multissistêmica do definhamento do suíno (SMDS), uma doença mundialmente disseminada e que provoca perdas econômicas significativas para a suinocultura. Visando contribuir no diagnóstico da síndrome, o presente trabalho padronizou e comparou testes para a detecção do PCV2. Para isso, foram utilizadas as técnicas de amplificação por círculo rolante (ACR) e variações da PCR (convencional, tempo-real e competitiva). Utilizando a ACR foi possível obter a amplificação total de genomas do PCV2, os quais foram clonados, sequenciados e agrupados no genótipo PCV2b. Os genomas clonados foram isolados, recircularizados e transfectados em células PK-15. Este procedimento possibilitou a recuperação do vírus infeccioso em títulos de até 105,55 DICC50/mL. Portanto, a ACR foi uma ferramenta útil em estratégias de isolamento e sequenciamento do vírus. No entanto, a ACR foi menos sensível que a PCR para fins de detecção do PCV2. No segundo estudo, buscando métodos auxiliares no diagnóstico da SMDS, dois ensaios para a quantificação do PCV2 foram desenvolvidos. Estes ensaios foram baseados nas técnicas de PCR competitivo (cPCR) e de PCR em tempo real. Visando determinar qual seria o mais adequado para estimar a carga viral do PCV2, os dois métodos foram comparados. Ambos os ensaios foram capazes de detectar diferenças significativas entre o número de cópias de DNA de PCV2 encontradas em tecidos de animais saudáveis e acometidos pela SMDS (≥ 2,5 log10). No entanto, uma diferença média de 1,8 log10 na carga viral foi encontrada entre ensaios, onde as maiores cargas virais foram detectadas pela PCR em tempo real. Outro objetivo deste trabalho foi gerar vacinas baseadas na proteína do capsídeo (Cap) do PCV2. Assim, no terceiro estudo, três baculovírus recombinantes foram construídos de modo a expressar a proteína Cap. Em dois recombinantes, a seqüência de nucleotídeos do peptídeo sinal (PS) da glicoproteína I do herpesvírus bovino (BoHV-gI) foi inserida na extremidade 5’ do gene cap (ORF2). Além disso, um recombinante contendo a seqüência de nucleotídeos do PS foi construído sem o sinal de localização nuclear (NLS) de proteína Cap. Através do ensaio de imunoperoxidase em monocamada (IPMA), antígenos de PCV2 foram detectados em células Sf21 infectadas pelos três vírus recombinantes. Este resultado sugere que os recombinantes construídos são potenciais candidatos vacinais, uma vez que eles foram capazes de produzir antígenos de PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the major agent of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a worldwide spread disease that causes significant economic losses to the swine productive chain. Aiming to contribute in the diagnosis of the syndrome, this thesis compared and developed tests for PCV2 detection. For this, multiply-primed rolling-circle amplification (MPRCA) and PCR-based assays (conventional, real-time and competitive) were tested. The MPRCA allowed amplifying the full-length PCV2 genomes, which were cloned, sequenced and grouped on PCV2b genotype. The cloned genomes were isolated from the plasmids, recircularized and used for transfection in PK-15 cells. This procedure led to the production of infectious virus to titres up to 105.55 TCID50/mL. It was concluded that MPRCA is a useful tool to amplify PCV2 genomes in sight of sequencing and virus isolation strategies. However, it was less sensitive than PCR for diagnostic purposes. In the second study, searching for methods in support to PMWS diagnosis, two PCR assays were developed: a competitive PCR (cPCR) and a SYBR green real-time PCR. The quantitative PCR methods were compared to determine which would be more suitable to estimate the PCV2 DNA load. Both assays were able to detect significant differences between the numbers of PCV2 DNA copies found in tissues of PMWS-affected and non-PMWS-affected pigs (≥2.5 log10). However, a mean difference of 1.8 log10 on the viral load was found between assays, where the highest viral loads were detected by SYBR green real-time PCR. In the work outlined herein, another purpose was to generate vaccine candidates based on PCV2 capsid protein (Cap). Therefore, in the third study, three types of recombinant baculoviruses were constructed to express the Cap protein. In two recombinants, the nucleotide sequence from the signal peptide (SP) of bovine herpesvirus glycoprotein I (BoHV-gI) was inserted at the 5’ end of the cap gene (ORF2). Additionally, one recombinant containing the SP nucleotide sequence was constructed lacking the nuclear localization signal (NLS) of Cap protein. Through immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), the PCV2 antigen was detected in Sf21 cells infected by the three recombinant viruses. This result suggests that the recombinants here constructed are potential vaccine candidates, once they were able to produce PCV2 antigens.

Os métodos convencionais para o diagnóstico da tuberculose (TB) pleural possuem várias limitações, assim métodos mais sensíveis e específicos são necessários. O objetivo deste estudo foi avaliar uma metodologia de hibridização em microplaca e uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis em amostras de líquido pleural, fragmento de pleura e soro. Adicionalmente, foi avaliada a utilidade da PCR em tempo real em paralelo com a cultura do líquido pleural para o diagnóstico de TB pleural. Foram avaliados 161 pacientes com derrame pleural e submetidos à toracocentese e biópsia pleural. O padrão-ouro para definição de um caso de TB pleural baseou-se na combinação de baciloscopia, cultura, exame histopatológico e critérios clínicos. Cento e sete dos 161 pacientes com derrame pleural receberam diagnóstico de TB pleural. Os resultados da metodologia de hibridização em microplaca não foram satisfatórios, assim foi desenvolvida uma técnica de PCR em tempo real. Nas amostras de líquido pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 46% (IC 95%, 36%-56%) com especificidade de 100%, enquanto a cultura obteve uma sensibilidade de 29% (IC 95%, 20%- 38%). A PCR em tempo real realizada em associação com a cultura no líquido pleural apresentou uma sensibilidade de 60% (IC 95%, 50%-70%). Para as amostras de fragmento pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 42% (IC 95%, 26%-59%) e especificidade de 100%, para este tipo de amostra o exame histopatológico apresentou a maior sensibilidade (90% - IC 95%, 84%- 96%). Nas amostras de soro a PCR em tempo real foi positiva em apenas dois pacientes, os quais também apresentaram resultado positivo nos outros tipos de amostras. Estes resultados indicam que a PCR em tempo real realizada no líquido pleural pode ser uma forma útil para obter um diagnóstico de TB pleural mais rápido, específico e com um procedimento menos invasivo para coleta das amostras. / Conventional tests for pleural tuberculosis (TB) have several limitations and more sensitive and specific methods are needed. The aim of this study was to evaluate microwell hybridization and real-time PCR (polimerase chain reaction) for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in pleural fluid, pleural tissue and serum. Additionally, the utility of real-time PCR in parallel with culture in pleural fluid for the diagnosis of pleural TB was assessed. One hundred sixty one patients with a pleural effusion submitted to a thoracentesis and pleural biopsy were evaluated. The gold-standard for case definition of pleural TB were the combination of acid-fast bacilli, culture, histopathologic examination and clinical parameters. One hundred seven of the 161 patients with pleural effusion received diagnosis of pleural TB. Results of microwell hybridization were not satisfactory, thus we developed a real-time PCR assay. In pleural fluid specimens, real-time PCR showed a sensitivity of 46% (CI 95%, 36%-56%) with specificity of 100%, while the sensitivity of culture was 29% (CI 95%, 20%-38%). The combination of real time PCR and culture in pleural fluid showed a sensitivity of 60% (CI 95%, 50%-70%). For the pleural tissue, real-time PCR showed a sensitivity of 42% (CI 95%, 26%-59%) with specificity of 100%, for this specimen histopathologic examination had the highest sensitivity (90% - CI 95%, 84%-96%). In the serum real-time PCR was positive in only two patients, which also had positive results in other specimens. Our results indicate that the real-time PCR is a useful approach to achieve a more rapid and specific diagnosis for pleural TB with a less invasive procedure for specimen collection.

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.

Os métodos convencionais para o diagnóstico da tuberculose (TB) pleural possuem várias limitações, assim métodos mais sensíveis e específicos são necessários. O objetivo deste estudo foi avaliar uma metodologia de hibridização em microplaca e uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis em amostras de líquido pleural, fragmento de pleura e soro. Adicionalmente, foi avaliada a utilidade da PCR em tempo real em paralelo com a cultura do líquido pleural para o diagnóstico de TB pleural. Foram avaliados 161 pacientes com derrame pleural e submetidos à toracocentese e biópsia pleural. O padrão-ouro para definição de um caso de TB pleural baseou-se na combinação de baciloscopia, cultura, exame histopatológico e critérios clínicos. Cento e sete dos 161 pacientes com derrame pleural receberam diagnóstico de TB pleural. Os resultados da metodologia de hibridização em microplaca não foram satisfatórios, assim foi desenvolvida uma técnica de PCR em tempo real. Nas amostras de líquido pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 46% (IC 95%, 36%-56%) com especificidade de 100%, enquanto a cultura obteve uma sensibilidade de 29% (IC 95%, 20%- 38%). A PCR em tempo real realizada em associação com a cultura no líquido pleural apresentou uma sensibilidade de 60% (IC 95%, 50%-70%). Para as amostras de fragmento pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 42% (IC 95%, 26%-59%) e especificidade de 100%, para este tipo de amostra o exame histopatológico apresentou a maior sensibilidade (90% - IC 95%, 84%- 96%). Nas amostras de soro a PCR em tempo real foi positiva em apenas dois pacientes, os quais também apresentaram resultado positivo nos outros tipos de amostras. Estes resultados indicam que a PCR em tempo real realizada no líquido pleural pode ser uma forma útil para obter um diagnóstico de TB pleural mais rápido, específico e com um procedimento menos invasivo para coleta das amostras. / Conventional tests for pleural tuberculosis (TB) have several limitations and more sensitive and specific methods are needed. The aim of this study was to evaluate microwell hybridization and real-time PCR (polimerase chain reaction) for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in pleural fluid, pleural tissue and serum. Additionally, the utility of real-time PCR in parallel with culture in pleural fluid for the diagnosis of pleural TB was assessed. One hundred sixty one patients with a pleural effusion submitted to a thoracentesis and pleural biopsy were evaluated. The gold-standard for case definition of pleural TB were the combination of acid-fast bacilli, culture, histopathologic examination and clinical parameters. One hundred seven of the 161 patients with pleural effusion received diagnosis of pleural TB. Results of microwell hybridization were not satisfactory, thus we developed a real-time PCR assay. In pleural fluid specimens, real-time PCR showed a sensitivity of 46% (CI 95%, 36%-56%) with specificity of 100%, while the sensitivity of culture was 29% (CI 95%, 20%-38%). The combination of real time PCR and culture in pleural fluid showed a sensitivity of 60% (CI 95%, 50%-70%). For the pleural tissue, real-time PCR showed a sensitivity of 42% (CI 95%, 26%-59%) with specificity of 100%, for this specimen histopathologic examination had the highest sensitivity (90% - CI 95%, 84%-96%). In the serum real-time PCR was positive in only two patients, which also had positive results in other specimens. Our results indicate that the real-time PCR is a useful approach to achieve a more rapid and specific diagnosis for pleural TB with a less invasive procedure for specimen collection.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente da síndrome multissistêmica do definhamento do suíno (SMDS), uma doença mundialmente disseminada e que provoca perdas econômicas significativas para a suinocultura. Visando contribuir no diagnóstico da síndrome, o presente trabalho padronizou e comparou testes para a detecção do PCV2. Para isso, foram utilizadas as técnicas de amplificação por círculo rolante (ACR) e variações da PCR (convencional, tempo-real e competitiva). Utilizando a ACR foi possível obter a amplificação total de genomas do PCV2, os quais foram clonados, sequenciados e agrupados no genótipo PCV2b. Os genomas clonados foram isolados, recircularizados e transfectados em células PK-15. Este procedimento possibilitou a recuperação do vírus infeccioso em títulos de até 105,55 DICC50/mL. Portanto, a ACR foi uma ferramenta útil em estratégias de isolamento e sequenciamento do vírus. No entanto, a ACR foi menos sensível que a PCR para fins de detecção do PCV2. No segundo estudo, buscando métodos auxiliares no diagnóstico da SMDS, dois ensaios para a quantificação do PCV2 foram desenvolvidos. Estes ensaios foram baseados nas técnicas de PCR competitivo (cPCR) e de PCR em tempo real. Visando determinar qual seria o mais adequado para estimar a carga viral do PCV2, os dois métodos foram comparados. Ambos os ensaios foram capazes de detectar diferenças significativas entre o número de cópias de DNA de PCV2 encontradas em tecidos de animais saudáveis e acometidos pela SMDS (≥ 2,5 log10). No entanto, uma diferença média de 1,8 log10 na carga viral foi encontrada entre ensaios, onde as maiores cargas virais foram detectadas pela PCR em tempo real. Outro objetivo deste trabalho foi gerar vacinas baseadas na proteína do capsídeo (Cap) do PCV2. Assim, no terceiro estudo, três baculovírus recombinantes foram construídos de modo a expressar a proteína Cap. Em dois recombinantes, a seqüência de nucleotídeos do peptídeo sinal (PS) da glicoproteína I do herpesvírus bovino (BoHV-gI) foi inserida na extremidade 5’ do gene cap (ORF2). Além disso, um recombinante contendo a seqüência de nucleotídeos do PS foi construído sem o sinal de localização nuclear (NLS) de proteína Cap. Através do ensaio de imunoperoxidase em monocamada (IPMA), antígenos de PCV2 foram detectados em células Sf21 infectadas pelos três vírus recombinantes. Este resultado sugere que os recombinantes construídos são potenciais candidatos vacinais, uma vez que eles foram capazes de produzir antígenos de PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the major agent of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a worldwide spread disease that causes significant economic losses to the swine productive chain. Aiming to contribute in the diagnosis of the syndrome, this thesis compared and developed tests for PCV2 detection. For this, multiply-primed rolling-circle amplification (MPRCA) and PCR-based assays (conventional, real-time and competitive) were tested. The MPRCA allowed amplifying the full-length PCV2 genomes, which were cloned, sequenced and grouped on PCV2b genotype. The cloned genomes were isolated from the plasmids, recircularized and used for transfection in PK-15 cells. This procedure led to the production of infectious virus to titres up to 105.55 TCID50/mL. It was concluded that MPRCA is a useful tool to amplify PCV2 genomes in sight of sequencing and virus isolation strategies. However, it was less sensitive than PCR for diagnostic purposes. In the second study, searching for methods in support to PMWS diagnosis, two PCR assays were developed: a competitive PCR (cPCR) and a SYBR green real-time PCR. The quantitative PCR methods were compared to determine which would be more suitable to estimate the PCV2 DNA load. Both assays were able to detect significant differences between the numbers of PCV2 DNA copies found in tissues of PMWS-affected and non-PMWS-affected pigs (≥2.5 log10). However, a mean difference of 1.8 log10 on the viral load was found between assays, where the highest viral loads were detected by SYBR green real-time PCR. In the work outlined herein, another purpose was to generate vaccine candidates based on PCV2 capsid protein (Cap). Therefore, in the third study, three types of recombinant baculoviruses were constructed to express the Cap protein. In two recombinants, the nucleotide sequence from the signal peptide (SP) of bovine herpesvirus glycoprotein I (BoHV-gI) was inserted at the 5’ end of the cap gene (ORF2). Additionally, one recombinant containing the SP nucleotide sequence was constructed lacking the nuclear localization signal (NLS) of Cap protein. Through immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), the PCV2 antigen was detected in Sf21 cells infected by the three recombinant viruses. This result suggests that the recombinants here constructed are potential vaccine candidates, once they were able to produce PCV2 antigens.