A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2018-06-05T17:44:09Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Henrique Moreira da Fé - 2018.pdf: 1985149 bytes, checksum: 20d3ea58da14d653dfbb18d338dbb1b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-06T11:04:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Henrique Moreira da Fé - 2018.pdf: 1985149 bytes, checksum: 20d3ea58da14d653dfbb18d338dbb1b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T11:04:33Z (GMT). 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The molecular methods are more accurate, however the molecular method most commonly used (PCR) requires a long time of reaction and requires sophisticated instrumentation and high cost, making point of care applications difficult,, especially in developing countries. This work presents the development of a molecular diagnostic methodology in a paper-based platform that allowed the detection of the virus through the reverse transcription -loop mediated isothermal amplification (RT-LAMP). The reactions were carried out on 6 mm diameter FTA paper discs, confined in a multi-layered polyester-toner device, incubated at 65 ° C for 45 minutes in a dry bath and then performed visual detection using the SYBR Green intercalator. Positive reactions were identified by the green fluorescence emitted after the addition of the intercalator. The results were recorded through the capture of the images by a photodocumentator and/or by smartphone and later analyzed by the software ImageJ, allowing the comparison between negative and positive reactions. The methodology developed for the detection of the virus by RT-LAMP in paper substrate was sensitive, being able to detect the virus in initial concentrations of 0.1 pg μL -1 of RNA in the master mixture. In addition, it was possible to detect the virus directly in complex samples (serum of infected patients) without the need of previous viral RNA extraction step. Elimination of the RNA extraction step together with the visual detection on the paper produce the final result in 46 minutes. The results demonstrated that the detection of the virus by RT-LAMP in paper substrates is a valuable tool for the molecular diagnosis of infectious diseases, presenting great potential for point-of-care applications for both diagnostics and epidemiological studies, especially in developing countries. / A dengue e a zika são doenças infecciosas virais de ocorrência nos países de clima tropical e subtropical no qual vivem cerca de 3,6 bilhões de pessoas, estimando-se, no caso da dengue, que 50 a 100 milhões de novos casos da doença ocorram anualmente, gerando impactos econômicos, sociais e de saúde pública. A dengue e a zika têm sido usualmente diagnosticadas por métodos sorológicos que são em geral de baixa confiança, pois podem gerar resultados falso-positivos, que estão relacionados à presença de anticorpos produzidos contra infecções anteriores do vírus. Os métodos moleculares são mais precisos, porém o método molecular mais utilizado atualmente (PCR) requer longo tempo de realização e necessita de instrumentação sofisticada e de alto custo, dificultando sua aplicação no ponto de atendimento, especialmente em países em desenvolvimento. Este trabalho apresenta o desenvolvimento de uma metodologia de diagnóstico molecular em uma plataforma a base de papel que permitiu a detecção do vírus por meio da reação de transcrição reversa seguida pela amplificação isotérmica mediada por loop (RTLAMP). As reações foram realizadas em discos de papel FTA com 6 mm de diâmetro, confinado em dispositivo multicamadas de poliéster-toner, incubados à 65 °C por 45 minutos em banho seco e posteriormente realizado a detecção visual onchip, através da utilização do intercalador SYBR Green. As reações positivas foram identificadas pela fluorescência verde emitida após a adição do intercalador. Os resultados foram registrados por meio da captura das imagens por uma fotodocumentadora e/ou por câmera de celular e posteriormente analisados pelo software ImageJ, permitindo a comparação entre reações negativas e positivas. A metodologia desenvolvida para a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de papel apresentou-se sensível, sendo capaz de detectar o vírus em concentrações iniciais de 0,1 pg µL-1 de RNA na mistura reacional. Além disso, foi possível detectar o vírus diretamente em amostras complexas (soro de pacientes infectados) sem a necessidade da etapa prévia de extração do RNA viral. A eliminação da etapa de extração do RNA juntamente com a realização da detecção visual no próprio papel proporcionou a obtenção do resultado final em 46 minutos. Os resultados demonstraram que a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de papel é uma importante ferramenta para o diagnóstico molecular de doenças infecciosas, apresentando grande potencial para aplicações no ponto de atendimento tanto para diagnósticos quanto para estudos epidemiológicos, especialmente em países em desenvolvimento.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente da síndrome multissistêmica do definhamento do suíno (SMDS), uma doença mundialmente disseminada e que provoca perdas econômicas significativas para a suinocultura. Visando contribuir no diagnóstico da síndrome, o presente trabalho padronizou e comparou testes para a detecção do PCV2. Para isso, foram utilizadas as técnicas de amplificação por círculo rolante (ACR) e variações da PCR (convencional, tempo-real e competitiva). Utilizando a ACR foi possível obter a amplificação total de genomas do PCV2, os quais foram clonados, sequenciados e agrupados no genótipo PCV2b. Os genomas clonados foram isolados, recircularizados e transfectados em células PK-15. Este procedimento possibilitou a recuperação do vírus infeccioso em títulos de até 105,55 DICC50/mL. Portanto, a ACR foi uma ferramenta útil em estratégias de isolamento e sequenciamento do vírus. No entanto, a ACR foi menos sensível que a PCR para fins de detecção do PCV2. No segundo estudo, buscando métodos auxiliares no diagnóstico da SMDS, dois ensaios para a quantificação do PCV2 foram desenvolvidos. Estes ensaios foram baseados nas técnicas de PCR competitivo (cPCR) e de PCR em tempo real. Visando determinar qual seria o mais adequado para estimar a carga viral do PCV2, os dois métodos foram comparados. Ambos os ensaios foram capazes de detectar diferenças significativas entre o número de cópias de DNA de PCV2 encontradas em tecidos de animais saudáveis e acometidos pela SMDS (≥ 2,5 log10). No entanto, uma diferença média de 1,8 log10 na carga viral foi encontrada entre ensaios, onde as maiores cargas virais foram detectadas pela PCR em tempo real. Outro objetivo deste trabalho foi gerar vacinas baseadas na proteína do capsídeo (Cap) do PCV2. Assim, no terceiro estudo, três baculovírus recombinantes foram construídos de modo a expressar a proteína Cap. Em dois recombinantes, a seqüência de nucleotídeos do peptídeo sinal (PS) da glicoproteína I do herpesvírus bovino (BoHV-gI) foi inserida na extremidade 5’ do gene cap (ORF2). Além disso, um recombinante contendo a seqüência de nucleotídeos do PS foi construído sem o sinal de localização nuclear (NLS) de proteína Cap. Através do ensaio de imunoperoxidase em monocamada (IPMA), antígenos de PCV2 foram detectados em células Sf21 infectadas pelos três vírus recombinantes. Este resultado sugere que os recombinantes construídos são potenciais candidatos vacinais, uma vez que eles foram capazes de produzir antígenos de PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the major agent of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a worldwide spread disease that causes significant economic losses to the swine productive chain. Aiming to contribute in the diagnosis of the syndrome, this thesis compared and developed tests for PCV2 detection. For this, multiply-primed rolling-circle amplification (MPRCA) and PCR-based assays (conventional, real-time and competitive) were tested. The MPRCA allowed amplifying the full-length PCV2 genomes, which were cloned, sequenced and grouped on PCV2b genotype. The cloned genomes were isolated from the plasmids, recircularized and used for transfection in PK-15 cells. This procedure led to the production of infectious virus to titres up to 105.55 TCID50/mL. It was concluded that MPRCA is a useful tool to amplify PCV2 genomes in sight of sequencing and virus isolation strategies. However, it was less sensitive than PCR for diagnostic purposes. In the second study, searching for methods in support to PMWS diagnosis, two PCR assays were developed: a competitive PCR (cPCR) and a SYBR green real-time PCR. The quantitative PCR methods were compared to determine which would be more suitable to estimate the PCV2 DNA load. Both assays were able to detect significant differences between the numbers of PCV2 DNA copies found in tissues of PMWS-affected and non-PMWS-affected pigs (≥2.5 log10). However, a mean difference of 1.8 log10 on the viral load was found between assays, where the highest viral loads were detected by SYBR green real-time PCR. In the work outlined herein, another purpose was to generate vaccine candidates based on PCV2 capsid protein (Cap). Therefore, in the third study, three types of recombinant baculoviruses were constructed to express the Cap protein. In two recombinants, the nucleotide sequence from the signal peptide (SP) of bovine herpesvirus glycoprotein I (BoHV-gI) was inserted at the 5’ end of the cap gene (ORF2). Additionally, one recombinant containing the SP nucleotide sequence was constructed lacking the nuclear localization signal (NLS) of Cap protein. Through immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), the PCV2 antigen was detected in Sf21 cells infected by the three recombinant viruses. This result suggests that the recombinants here constructed are potential vaccine candidates, once they were able to produce PCV2 antigens.

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.