Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Vriesea reitzii Leme & Costa é uma bromélia da Floresta Atlântica, ocorre em altitudes que variam de 750 a 1200m, e é endêmica no estado de Santa Catarina. Em um contexto de coleta desordenada e ameaça de extinção, destaca-se a importância das técnicas de cultura de tecidos, as quais possibilitam a propagação massal desta espécie e a redução da pressão de coleta na natureza. O sistema regenerativo definido como Culturas Nodulares (CNs) configura como uma estratégia eficiente para a micropropagação dessa bromélia, visto que culmina na produção múltipla de brotos adventícios. Supõe-se que a aquisição da competência celular in vitro para a obtenção de CNs é modulada pelos percentuais de metilação global do DNA e pelo conteúdo de poliaminas livres, e que ambos são mediadores-chave da morfogênse in vitro e estão envolvidos na regulação da expressão gênica. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica da metilação global do DNA nuclear e das poliaminas (PAs) livres endógenas durante a indução e o desenvolvimento inicial das culturas nodulares (CNs) provenientes de explantes foliares de brotos in vitro de Vriesea reitzii. Para tanto, brotos submetidos a sucessivos subcultivos em meio MS básico líquido suplementado com ANA (2 µM) mais BAP (4 µM) foram individualizados, padronizados por tamanho e incubados em meio MSB líquido isento de fitorreguladores. Após 3 semanas, esses brotos foram utilizados como fonte de explantes para excisão das bases foliares. Bases foram inoculadas sobre ponte de papel em tubos de ensaio contendo meio MSB líquido suplementado com ANA (4 µM) + BAP (2 µM). Amostras representativas foram coletadas em T0 (base segmentada, mas não inoculada), T1, T2, T3 e T4 (uma, duas, três e quatro semanas de cultivo, respectivamente.) e congeladas a -80ºC. Bases foliares recém-coletadas nos respectivos tempos de cultivo foram submetidas à caracterização morfológica por meio de registro em microscópio estereoscópio e a análises histoquímicas. Amostras obtidas nos tempos de cultivo descritos foram submetidas à extração de DNA, à posterior digestão de ácidos nucléicos, e à detecção da porcentagem de metilação da citosina (% 5mdC) em HPLC/UV. Amostras dos mesmos tempos de cultivo foram submetidas à identificação e quantificação das PAs em HPLC/UV após extração e dansilação delas. As culturas nodulares originam-se a partir da proliferação de células meristemáticas da base foliar e em duas semanas de cultivo evidenciou-se a sua formação. Durante a indução de CNs observou-se um decréscimo expressivo nos percentuais de metilação (5mdC) também evidenciado em T2, sendo que em T0 houve 24,8% de metilação e em T4 12,5%. Portanto, existe uma correlação entre percentuais de 5mdC e competência para indução de CNs e o evento epigenético envolvido na morfogênese in vitro foi a demetilação. Os teores endógenos das PAs livres Espermidina (Spd) e Espermina (Spm) mantiveram-se constantes durante a indução das CNs. A Putrescina (Put) apresentou um aumento a partir de T2 o que indica que o seu envolvimento na divisão celular.<br> / Abstract : Vriesea reitzii Leme & Coasta is a bromeliad from the Atlantic Forest, occurs at elevations ranging from 750 to 1200m, and is endemic in the state of Santa Catarina. In a context of disordered collection and threat of extinction, we highlight the importance of tissue culture techniques, which the mass propagation of this species and the reduction of pressure in the natural habitat. The regenerative system defined as Nodule Clusters (NCs) configured as an efficient strategy for micropropagation of this bromeliad, since culminates in the production of multiple adventitious shoots. It is assumed that the acquisition of in vitro cell competence to obtain NCs is modulated by the global methylation percentage of the DNA and the content of free polyamines , and both are key mediators in vitro morphogenesis and are involved in regulating the expression gene. So, the aim of this study was to evaluate the dynamics of the global nuclear DNA methylation and polyamines (PAs) endogenous free during induction and early development of nodule clusters (NCs) from leaf explants of in vitro shoots of Vriesea reitzii. For both, shoots subjected to successive subcultures in MS medium supplemented with NAA net (2 mM) plus BAP (4 mM) were individualized, standardized by size and incubated in MSB liquid medium free of growth regulators. After 3 weeks, these buds were used as source of explants for excision of leaf bases. Bases were inoculated on paper bridge in test tubes containing MSB liquid medium supplemented with NAA (4 mM) + BAP (2 mM). Representative samples were taken at T0 (segmented basis but not inoculated) T1, T2, T3 and T4 (one, two, three and four weeks of culture, respectively). And frozen at -80°C. Freshly collected in their times of cultivation bases underwent morphological characterization by registering a stereoscopic microscope and histochemical analyzes. Samples obtained in cultivation periods described were subjected to DNA extraction, the subsequent digestion of nucleic acids, and detection of the percentage of cytosine methylation (% 5mdC) HPLC/UV. Samples from the same culture times were submitted for identification and quantification of PAs in HPLC / UV after extraction and dansylation them. Nodule clusters arise from the proliferation of meristematic cells of leaf base and in two weeks of culture showed up his training. During induction of NCs observed a significant decrease in the percentage of methylation (5mdC) also evidenced in T2, and was 24.8% at T0 and T4 methylation of 12.5 %. Therefore, there is a correlation between percentage of 5mdC and competence for induction of NCs and the epigenetic event involved in morphogenesis in vitro was demethylation. The endogenous levels of free PAs spermidine (Spd) and Spermine (Spm) remained constant during the induction of NCs. The Putrescine (Put) showed an increase from T2 indicating that their involvement in cell division.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/128842 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Vieira, Pâmela Martins |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Pescador, Rosete, Dal Vesco, Lirio Luiz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 64 p.| il., grafs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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