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Previous issue date: 2005-11-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are toxins frequently found in snake venoms. Their biological
effects are due to their binding to cell receptors known as integrins. Aiming to isolate
new disintegrins from Bothrops alternatus snake, a cDNA library was constructed
upon the transcripts expressed in the venom gland from one specimen. Two
disintegrins, called DisBa-01 and DisBa-02 were cloned and sequenced. The
amplification of other medium-size disintegrins and metalloprotease-disintegrins was
also achieved. The recombinant toxin, DisBa-01, was expressed in an optimized
bacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and tested in
several biological assays. The toxin inhibited the platelet aggregation (IC50= 235nM)
induced by collagen in rabbit s platelets rich plasma (PRP). Using ADP as inductor,
the platelet aggregation inhibition was also observed in PRP from rabbits (IC50=
124nM) and human (IC50= 475nM), as well as in washed platelets from mice (IC50=
25nM). Competition assays for the αIIbβ3 integrin using specific ligands, fibrinogen
and a specific antibody against activated αIIbβ3, revealed that the toxin strongly
binds to this receptor (respectively IC50=18nM and IC50=70nM). Furthermore, the
toxin inhibited the proliferation of cells that representatively express αVβ3 integrin,
HMEC-1 and B16F10-2B8, in a dose/time dependent manner and the adhesion of
B16F10-2B8 to vitronectin (IC50= 225nM). In vivo, the toxin significantly inhibited the
thrombus formation in arterioles (Treated: 58,4 ± 1,6 min.; Control: 24,3 ± 2,8 min.,
p<0,002) and venules (Treated: 46,6 ± 6,8min.; Control: 27,1 ± 1,3min., p<0,002),
prolonged the bleeding time (Treated: 989 ± 140 sec.; Control: 202 ± 22 sec.;
p<0,008) and inhibited the pulmonary mestastasis of B16F10-2B8 (~92%, 12 days
after the tumor cells injection). These results, as well as structural bioinformatics
studies strongly suggest the binding of the toxin with αIIbβ3 and αVb3 integrins, what
motivates further studies aiming the therapeutic/laboratorial application of DisBa-01
or its derivatives. / Desintegrinas são toxinas frequentemente encontradas em venenos de
serpentes e cujos efeitos biológicos relacionam-se com suas ligações a receptores
celulares conhecidos como integrinas. Visando o isolamento de novas desintegrinas
da serpente Bothrops alternatus, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de
transcritos presentes nas glândulas veneníferas de um espécime dessa serpente.
Duas desintegrinas, denominadas DisBa-01 e DisBa-02, foram clonadas e
seqüenciadas. Também foi possível a amplificação de outras prováveis
desintegrinas médias e metaloproteases-desintegrinas. A desintegrina, DisBa-01, foi
expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3)
pET28a+DisBa-01) e testada em uma série de ensaios biológicos. A toxina
recombinante inibiu a agregação plaquetária induzida por colágeno em plasma rico
em plaquetas (PRP) de coelhos (IC50= 235nM). Utilizando ADP como indutor
também se constatou a inibição da agregação plaquetárias em PRP de coelho (IC50=
124nM) e humano (IC50= 475nM), além da inibição da agregação de plaquetas
lavadas de camundongos (IC50= 25nM). Em ensaios de competição pela da integrina
αIIbβ3 na presença de ligantes específicos, obteve-se os IC50s de 18 e 70nM,
respectivamente, para o fibrinogênio e para um anticorpo específico contra a
integrina ativada. A toxina inibiu ainda a proliferação de células com expressão mais
representativa de integrina αVβ3, HMEC-1 e B16F10-2B8, de maneira dose/tempo
dependente, bem como adesão de células B16F10-2B8 à vitronectina (IC50=
225nM). In vivo, a toxina significativamente inibiu a formação de trombos em
arteríolas (Experimental: 58,4 ± 1,6 min; Controle: 24,3 ± 2,8 min, p<0,002) e
vênulas (Experimental: 46,6 ± 6,8min.; Controle: 27,1 ± 1,3min., p<0,002), prolongou
o tempo de sangramento (Experimental: 989 ± 140 segundos; Controle: 202 ± 22
segundos; p<0,008) e inibiu a formação de metástases pulmonares (~92% no 12°
dia após a injeção das células tumorais). Os resultados obtidos somados a estudos
por bioinformática estrutural sugerem fortemente a ligação com integrinas como a
αIIbβ3 e αVb3, motivando o prosseguimento de estudos visando a aplicação
terapêutica e/ou laboratorial da DisBa-01 ou possíveis derivados.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5359 |
| Date | 28 November 2005 |
| Creators | Ramos, Oscar Henrique Pereira |
| Contributors | Araújo, Heloísa Sobreiro Selistre de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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