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Efeitos de uma desintegrina RGD recombinante na migração de uma linhagem celular de carcinoma de células escamosas de origem oralMontenegro, Cyntia de Freitas 28 April 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-04-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cancer is a group of diseases related to abnormal cell growth and ability to invade
tissues. These skills result in the development of metastases, leading to death in many of
the patients. During the process of invasion, the cells find a connective tissue rich in
fibronectin and collagen in which they will have to go through in order to reach the
blood vessels and then the metastatic site. Fibronectin adhesion receptors such as αvβ3
and α5β1 integrins are essential for cells to be able to move through the fibronectin
fibers. Integrins bind to the extracellular matrix (ECM) proteins via the RGD motif
present in fibronectin, making these cell types migration receptors a potential target for
the study of cancer. Thus, the effect of DisBa-01, an RGD containing motif disintegrin,
was investigated in two cell specialized on migration; fibroblasts (BJ) and oral
squamous cell carcinoma (SCC25). DisBa-01 (1 and 2 μM) was able to reduce cancer
cells migration speed and directionality, but not fibroblasts, on time-lapse experiments
performed on fibronectin coated plates. In order to understand if the effect of DisBa-01
is associated with alterations in cellular adhesion, cells were plated on fibronectin and
stained with anti-paxillin. Images acquired by confocal microscopy show changes in
focal adhesions, which have become larger and more numerous. These data were
confirmed, by time-lapse assays using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) in
cells transfected with paxillin. The expression of key fibronectin receptors, α5, β3 and
αv is present similarly in both strains, while the β1 subunit is expressed in lower
amounts in OSCC cells. To investigate the probable relationship of migration inhibition
with integrin β3 level, this subunit was overexpressed in the OSCC cells and all
parameters analyzed were restored. Taken together, these results demonstrate the ability
of DisBa-01 to affect cell migration depending on integrin expression level and by
modulating the dynamics of cell adhesions. / O câncer representa um conjunto de doenças relacionadas ao crescimento anormal de
células e sua capacidade de invadir tecidos. Essas habilidades resultam no
desenvolvimento de metástases, que levam muitos dos pacientes acometidos por essa
doença, à morte. Durante o processo de invasão as células encontram um tecido
conectivo rico em fibronectina e colágeno, o qual terão que atravessar a fim de chegar
aos vasos sanguíneos e posteriormente ao sítio metastático. Receptores de adesão a
fibronectica como a αvβ3 e α5β1 são essenciais para que as células sejam capazes de se
movimentar sobre as fibras dessa protéína. A integrinas se ligam a fibronectina através
do motivo RGD presente, fazendo desses receptores, potenciais alvos no estudo da
migração celular durante o câncer. Assim, o efeito da DisBa-01, uma desintegrina com
motivo RGD, foi investigado em duas células especializadas em migração; fibroblastos
(BJ) e uma linhagem de carcinoma de células escamosas oral (SCC25). A DisBa-01 (1 e
2 μM) foi capaz de diminuir a velocidade de migração e a direcionalidade das células
de câncer, mas não dos fibroblastos, em ensaios de time-lapse realizados em placas
recobertas por fibronectina. Com o objetivo de entender se o efeito da DisBa-01 está
relacionado com alterações na adesões celulares, as células foram plaqueadas sobre
fibronectina e marcadas com anti-paxilina. Nas imagens adquiridas através de
microscopia confocal é possível visualizar mudanças nas adesões, que se tornaram
maiores e mais numerosas. Dados que foram confirmados em ensaios de time-lapse
utilizando a microscopia de fluorescência de reflecção interna total (TIRF – Total
Internal Reflection Fluorescence) em células transfectadas com paxilina. A expressão
dos principais receptores de fibronectina, α5, αv e β3 está presente de forma similar nas
duas linhagens, enquanto a subunidade β1 é expressa em quantidades menores nas
células OSCC. Para investigar a provavel relação da inibição da migração com a
expressão da integrina β3, a mesma foi superexpressa em nas células de OSCC e todos
os parâmetros analizados foram normalizados. Em conjunto, esses resultados
demonstram a capacidade da DisBa-01 de afetar a migração celular dependendo do
nível de expressão de integrinas e através da modulação da dinâmica das adesões.
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Estudo da atividade biológica do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da botropasina / Biological activity study of ecd motif of disintegrinlike domain of bothropasinIke, Priscila Tomie Leme 10 May 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-05-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / Integrins are cell surface receptors that mediate cell adhesion and platelet aggregation, although they do part of important physiological processes in the organism, are also related pathologies such as tumorigenesis, metastasis and thrombosis. Thus integrins are important targets in development of drugs for the treatment of these diseases. Snake venoms metalloproteases (SVMPs) of PII and PIII class possessing a disintegrin domain, capable of binding to integrins inhibiting its activity, have been widely studied for this purpose. PII-SVMPs bind integrins via the RGD motif found in disintegrin domain. PIII-SVMPs have three domains: metalloprotease (M), disintegrin-like (D) with the ECD motif instead of RGD and 'Cysteine-rich' domain (C). PIII-SVMPs containing only DC domains are able to interact with integrins inhibiting cell adhesion and platelet aggregation. However it is not known which region of these molecules is involved in binding to integrins, and two regions are identified as likely responsible for integrin-ligand interactions: the motif ECD and a region called the hyper variable region (HVR) present in some PIII-SVMPs. The intention here was to assist the understanding of this interaction, assessing the importance of ECD motif present in disintegrin-like domain of Bothropasin, a PIIISVMP. For the three-dimensional structure of bothropasin, we have that in the ECD motif, aspartic residue (D) made a interaction with calcium ions, and cysteine (C) is involved in a disulfide bridge, but the glutamic acid (E) which is very reactive, is free to interact with other molecules. Thus, the proposal was to obtain a recombinant molecule consisting in the D and C domains of bothropasin (BDC) and a mutant molecule (BDC-ACD), where the glutamic residue of EDC motif present in disintegrin-like domain of BDC is replaced by a alanine residue. BDC-ACD, was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using the QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, with the DNA template pGEX-4T-BDC and primers containing the desired mutation. The recombinant proteins were expressed in the soluble form in fusion with glutathione Stransferase protein. Purification of recombinants proteins was made in Glutathione Sepharose resin and the fusion proteins, immobilized on the resin were cleaved with enzyme thrombin. BDC and BDC-DCA were evaluated for their ability to inhibition of platelet aggregation which found that the mutation did not cause a significant change in protein activity, indicating that the glutamic residue of ECD motif is not involved in connection with integrins. Were also assayed for inhibition of adhesion of breast adenocarcinoma cells (MDA-MB- 231) to collagen and no inhibition was observed suggesting that, like the other PIII-SVMPs, BDC interact with α2 subunits of intergrins, which are not expressed in tested cells. / As integrinas são receptores de superfície celular capazes de mediar a adesão celular e a agregação plaquetária, que embora façam parte de importantes processos fisiológicos no organismo também estão relacionados a patologias como tumorogênese, metástase e trombose. Deste modo as integrinas constituem importantes alvos no desenvolvimento de drogas para o tratamento dessas doenças. Metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs) das classes PII e PIII por possuírem um domínio desintegrina, capazes de se ligar às integrinas inibindo sua atividade, têm sido amplamente estudadas com esse intuito. PIISVMPS se ligam as integrinas através do motivo RGD que se encontra no domínio desintegrina. PIII-SVMPs possuem três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) que apresenta o motivo ECD invés de RGD, e rico em cisteína (C). PIII-SVMPs contendo apenas os domínios DC são capazes de interagir com integrinas inibindo adesão celular e agregação plaquetária. Contudo não se sabe qual região dessas moléculas está envolvida na ligação às integrinas, sendo que duas regiões são apontadas como prováveis responsáveis pela interação integrina-ligante: o motivo ECD e uma região denominada região hiper variável (HVR) presente em algumas PIII-SVMPs. Foi pretendido aqui colaborar para o entendimento dessa interação, avaliando a importância do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da Botropasina, uma PIII-SVMP. Pela estrutura tridimensional da botropasina, tem-se que no motivo ECD o resíduo aspártico (D) faz uma interação com íon cálcio, e a cisteína (C) está envolvida em uma ponte dissulfeto, porém o glutâmico (E) que é bastante reativo, encontra-se livre para interagir com outras moléculas. Assim, a proposta deste trabalho foi obter a molécula recombinante constituída pelos domínios D e C da botropasina (BDC), e também uma molécula mutante (BDC-ACD), onde o glutâmico do motivo EDC do domínio tipo-desintegrina da BDC foi substituído por um resíduo de alanina. BDC-ACD, foi obtida através de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) com a utilização do QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, tendo como DNA molde pGEX-4T-BDC e primers contendo a mutação desejada. As proteínas recombinantes foram expressas na forma solúvel em fusão com a proteína glutationa S-transferase. A purificação das proteínas recombinantes foi feita em resina Glutathione Sepharose e as proteínas de fusão, imobilizadas na resina, foram clivadas com a enzima trombina. BDC e BDCACD foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibição da agregação plaquetária onde foi verificado que a mutação realizada não alterou significativamente a atividade das proteínas, indicando que o glutâmico do Dissertação de Mestrado de Priscila Tomie Leme Ike vi motivo ECD não está envolvido na ligação com a integrina. Também foram realizados ensaios de inibição da adesão de células de adenocarcinoma da mama (MDA-MB-231) ao colágeno e não houve inibição da adesão celular sugerindo que, assim como outras PIII-SVMPs, a BDC possa interagir com subunidades α2 de intergrinas, que não estavam expressas nas células testadas.
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Desintegrinas de Bothrops alternatus: biologia molecular, estudos in vitro, in vivo e bioinformática estrutural.Ramos, Oscar Henrique Pereira 28 November 2005 (has links)
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Previous issue date: 2005-11-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are toxins frequently found in snake venoms. Their biological
effects are due to their binding to cell receptors known as integrins. Aiming to isolate
new disintegrins from Bothrops alternatus snake, a cDNA library was constructed
upon the transcripts expressed in the venom gland from one specimen. Two
disintegrins, called DisBa-01 and DisBa-02 were cloned and sequenced. The
amplification of other medium-size disintegrins and metalloprotease-disintegrins was
also achieved. The recombinant toxin, DisBa-01, was expressed in an optimized
bacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and tested in
several biological assays. The toxin inhibited the platelet aggregation (IC50= 235nM)
induced by collagen in rabbit s platelets rich plasma (PRP). Using ADP as inductor,
the platelet aggregation inhibition was also observed in PRP from rabbits (IC50=
124nM) and human (IC50= 475nM), as well as in washed platelets from mice (IC50=
25nM). Competition assays for the αIIbβ3 integrin using specific ligands, fibrinogen
and a specific antibody against activated αIIbβ3, revealed that the toxin strongly
binds to this receptor (respectively IC50=18nM and IC50=70nM). Furthermore, the
toxin inhibited the proliferation of cells that representatively express αVβ3 integrin,
HMEC-1 and B16F10-2B8, in a dose/time dependent manner and the adhesion of
B16F10-2B8 to vitronectin (IC50= 225nM). In vivo, the toxin significantly inhibited the
thrombus formation in arterioles (Treated: 58,4 ± 1,6 min.; Control: 24,3 ± 2,8 min.,
p<0,002) and venules (Treated: 46,6 ± 6,8min.; Control: 27,1 ± 1,3min., p<0,002),
prolonged the bleeding time (Treated: 989 ± 140 sec.; Control: 202 ± 22 sec.;
p<0,008) and inhibited the pulmonary mestastasis of B16F10-2B8 (~92%, 12 days
after the tumor cells injection). These results, as well as structural bioinformatics
studies strongly suggest the binding of the toxin with αIIbβ3 and αVb3 integrins, what
motivates further studies aiming the therapeutic/laboratorial application of DisBa-01
or its derivatives. / Desintegrinas são toxinas frequentemente encontradas em venenos de
serpentes e cujos efeitos biológicos relacionam-se com suas ligações a receptores
celulares conhecidos como integrinas. Visando o isolamento de novas desintegrinas
da serpente Bothrops alternatus, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de
transcritos presentes nas glândulas veneníferas de um espécime dessa serpente.
Duas desintegrinas, denominadas DisBa-01 e DisBa-02, foram clonadas e
seqüenciadas. Também foi possível a amplificação de outras prováveis
desintegrinas médias e metaloproteases-desintegrinas. A desintegrina, DisBa-01, foi
expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3)
pET28a+DisBa-01) e testada em uma série de ensaios biológicos. A toxina
recombinante inibiu a agregação plaquetária induzida por colágeno em plasma rico
em plaquetas (PRP) de coelhos (IC50= 235nM). Utilizando ADP como indutor
também se constatou a inibição da agregação plaquetárias em PRP de coelho (IC50=
124nM) e humano (IC50= 475nM), além da inibição da agregação de plaquetas
lavadas de camundongos (IC50= 25nM). Em ensaios de competição pela da integrina
αIIbβ3 na presença de ligantes específicos, obteve-se os IC50s de 18 e 70nM,
respectivamente, para o fibrinogênio e para um anticorpo específico contra a
integrina ativada. A toxina inibiu ainda a proliferação de células com expressão mais
representativa de integrina αVβ3, HMEC-1 e B16F10-2B8, de maneira dose/tempo
dependente, bem como adesão de células B16F10-2B8 à vitronectina (IC50=
225nM). In vivo, a toxina significativamente inibiu a formação de trombos em
arteríolas (Experimental: 58,4 ± 1,6 min; Controle: 24,3 ± 2,8 min, p<0,002) e
vênulas (Experimental: 46,6 ± 6,8min.; Controle: 27,1 ± 1,3min., p<0,002), prolongou
o tempo de sangramento (Experimental: 989 ± 140 segundos; Controle: 202 ± 22
segundos; p<0,008) e inibiu a formação de metástases pulmonares (~92% no 12°
dia após a injeção das células tumorais). Os resultados obtidos somados a estudos
por bioinformática estrutural sugerem fortemente a ligação com integrinas como a
αIIbβ3 e αVb3, motivando o prosseguimento de estudos visando a aplicação
terapêutica e/ou laboratorial da DisBa-01 ou possíveis derivados.
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Efeitos das desintegrinas Alternagina-C e DisBa-01 de Bothrops alternatus em fibroblastos, células endoteliais e tumorais.Ribeiro, Juliana Uema 17 November 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-11-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are small cysteine-rich proteins with an RGD motif isolated from viperidae snake venoms. DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin from Bothrops alternatus snake venom, inhibits melanoma cell metastasis and also platelet aggregation in murine models by interactions with β3 integrin cell receptors. Also, this RGD-disintegrin inhibits human microvascular endothelial cell (HMEC-1) proliferation in vitro and angiogenesis in vivo. Alternagin-C (ALT-C), a disintegrin-like protein from Bothrops alternatus, is a potent inhibitor of the collagen binding to α2β1 integrin which plays an essential role in the adhesion of normal and tumor cells to the extracellular matrix. Also, this protein can modulate angiogenesis where low concentrations of ALT-C positively regulate the formation of new blood vessels, whereas high ALT-C concentrations negatively modulates this process. This work presents the effects of DisBa-01 and ALT-C: 1) on the adhesion of breast cancer invasive MDA-MB-231 cells to the ECM proteins and to the subendothelial matrix produced by HUVEC (human vascular endothelial cells) under static and dynamic conditions; and 2) on the VEGFRs expression on endothealial cells. ALT-C inhibited tumoral cell adeshion to almost ECM proteins individually and also to ECM. Only 10000nM ALT-C inhibited tumoral cell adhesion to the HUVEC matrix under static conditions. Under flow, tumoral adhesion were inhibited by 100nM and 1.000nM ALT-C. Flow induces α2β1 activation in endothelial cells and MDA-MB- 231 cells expressed high levels of α2β1. Thus, a possible activation of this integrin by the shear stress could enhance its interactions with ALT-C. DisBa-01 had no effect on the tumoral cell adhesion to HUVEC matrix under static conditions. On the other hand, under flow the RGD-disintegrin strongly inhibited tumoral and platelet adhesion. Thus, a possible activation of αVβ3 by flow could enhance its interactions with DisBa-01. About VEGFR expression, DisBa-01 down-regulated VEGFR-1 and VEGFR-2 expression in almost all tested concentrations. ALT-C up-regulates VEGFR-2 expression at lower concentration. These results can explain at least in part the effects of DisBa-01 and ALT-C in angiogenesis. The anti-adhesives and antiangiogenics ALT-C and DisBa-01 properties may be helpful for the study of tumoral metastasis as well as in the design of new therapeutic agents targeting tumor cell adhesion on extravasation and invasion steps. / As desintegrinas são pequenas proteínas isoladas de veneno de serpente, ricas em cisteína e com um motivo RGD. DisBa-01, uma desintegrina-RGD recombinante de do veneno de Bothrops alternatus, inibe metástase de melanoma e a agregação plaquetária em modelos murinos pela interação com integrinas β3. Além disso, a desintegrina-RGD inibe a proliferação endotelial in vitro e a angiogênese in vivo. Alternagina-C (ALT-C), uma desintegrina-like de Bothrops alternatus inibe a ligação ao colágeno através da integrina α2β1, a qual desempenha um papel essencial na adesão normal e tumoral a MEC. Esta proteína do veneno também pode modular a angiogênese, onde doses baixas de ALT-C regulam positivamente, ao passo que doses maiores inibem o processo. Este trabalho apresenta os efeitos de DisBa-01 e ALT-C: 1) na adesão de células de adenocarcinoma mamário MA-MB-231 a proteínas da MEC e MEC subendotelial, sobre condições estáticas e dinâmicas; e na expressão de VEGFR em células endoteliais. ALT-C inibiu a adesão das células tumorais a quase todos os componentes de MEC testados individualmente e também a MEC. Entetanto, somente uma dose alta da proteina, 10.000nM, teve efeito sobre a MEC em condições estáticas. Sob estresse de cisalhamento, a adesão tumoral foi totalmente inibida por ALT-C 100 e 1.000nM. O fluxo induz a ativação de α2β1. Assim, uma possível ativação das células por estresse de cisalhamento pode ter reforçado a interação com ALT-C. DisBa-01 não teve efeito na adesão tumoral sob condições estáticas. Por outro lado, sob fluxo a desintegrina-RGD inibiu fortemente a adesão tumoral. Assim, uma possível ativação de αVβ3 por fluxo pode ter reforçado as interações com DisBa-01. Sobre a expressão dos VEGFRs, DisBa-01 diminuiu o nivel de ambos em quase todas as concentrações testadas. ALT-C em baixas doses, por sua vez, aumentou a expressão do VEGFR-2. Tais resultados podem explicar, ao menos em parte, os efeitos de DisBa-01 e ALT-C na modulação da angiogênese. Os efeitos anti-adesivos e anti-angiogênicos de ALT-C e DisBa-01 podem ser úteis para o estudo de metástase tumoral, bem como para o desenho de novos agentes terapêuticos que ajam na adesão tumoral nas etapas de extravasamento e invasão.
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Ensaio pré-clínico da desintegrina recombinante DisBa-01 na angio-gênese inflamatória induzida por implantes sintéticos em camundongosVieira, Puebla Cassini 11 March 2014 (has links)
Angiogenesis and inflammation act simultaneously in several pathophysiological processes. The interactions with the extracellular matrix (ECM) are required in inflammatory angiogenesis. The non-enzymatic disintegrins comprise a family of peptides, low molecular weight, derived from the venom of snakes, which strongly inhibit the functions of integrins. In this study we evaluated the therapeutic effect of disintegrin DisBa-01, derived from the venom of the snake Rhinocerophis alternatus in inflammatory angiogenesis induced by synthetic implants in mice. Treatment with DisBa-01 inhibited the main key components of fibrovascular tissue induced by implants as inflammation and angiogenesis, without changing the fibrogenic component. This experimental model is the implementation of a synthetic matrix in the subcutaneous tissue of the animal, which induces the formation of fibrovascular tissue rich in inflammatory cells, blood vessels and MEC. The model of synthetic implants, also allows the simultaneous evaluation of inflammation, angiogenesis and tissue repair. The inhibitory effects of DisBa-01 were observed by MPO activity (representing activated neutrophils), NAG activity (representing activated macrophage), the chemokines CXCL -1, MCP-1 and the cytokine TNF- α. The anti-angiogenic activity was observed through the reduction of hemoglobin content, number of vessels, blood flow intra-implant by laser doppler and the levels of VEGF and FGF cytokines. The evaluation of DisBa-01 in multiple parameters provides additional evidence to the therapeutic potential of this disintegrin. / A angiogênese e a inflamação atuam simultaneamente em diversos processos fisiopatológicos. A angiogênese inflamatória é dependente de uma série de interações com a matriz extracelular (MEC) que são mediadas principalmente por receptores integrinas. Assim, peptídeos que possam atuar sobre as integrinas vêm sendo amplamente estudados. Alguns peptídeos como as desintegrinas funcionam como antagonistas das integrinas. As desintegrinas compreendem uma família de polipeptídeo não enzimáticos, de baixo peso molecular, derivados a partir da peçonha de serpentes, que inibem fortemente as funções das integrinas. Neste estudo avaliou-se o efeito terapêutico da desintegrina DisBa-01, derivada da peçonha da serpente Rhinocerophis alternatus na angiogênese inflamatória induzida por implantes sintéticos em camundongos. Este modelo experimental consiste na implantação de uma matriz sintética no tecido subcutâneo do animal, que induz a formação de tecido fibrovascular rico em células inflamatórias, vasos sanguíneos e MEC. O modelo de implantes sintéticos, também permite a avaliação concomitante da inflamação, angiogênese e do reparo tecidual. O tratamento intra-implante com diferentes doses de DisBa-01 inibiu os principais componentes inflamatórios e angiogênicos do tecido fibrovascular. Os efeitos anti-inflamatórios da DisBa-01 foram observados por reduções na atividade de MPO (representando neutrófilos ativados), NAG (representando macrófagos ativados), nas quimiocinas CXCL-1, MCP-1 e pela citocina TNF-α. A atividade anti-angiogênica foi observada através da redução do conteúdo de hemoglobina, do número de vasos em cortes histológicos, bem como por uma redução no fluxo sanguíneo intra-implante através da imagem de perfusão por laser doppler e dos níveis das citocinas pró-angiogênicas VEGF e FGF. No entanto, o tratamento não foi capaz de produzir efeitos significativos sobre os principais componentes do reparo tecidual, como o colágeno e a citocina TGF-β. A avaliação de DisBa-01 nos múltiplos parâmetros reveladas neste estudo demonstrou evidências adicionais ao potencial terapêutico desta desintegrina. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas
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Caracterização de disintegrinas de venenos viperídeos como ferramentas seletivas na detecção ou inibição da função de integrinas / Characterization of viper venom disintegrins as tools for detecting and inhibiting integrin functionWadsworth, Diego Alberto Butera 15 December 2003 (has links)
As integrinas são proteínas de membrana envolvidas em diversos processos biológicos como embriogênese, inflamação e agregação plaquetária. A alteração de seu padrão de expressão está relacionada com processos patológicos como trombose e câncer, fazendo das integrinas ótimos indicadores da progressão destas doenças. Assim, a integrina α2β1 pode ser considerada como indicadora de angiogênese, sendo expressa nas células endoteliais durante o crescimento de novos vasos. Já a ausência da αIIbβ3 em plaquetas está relacionada com a doença de Glanzmann, caracterizada por uma agregação plaquetária deficiente, e sua presença em outros tipos celulares está relacionada com processos de metástase e invasão de tecidos. Estas integrinas contêm antagonistas naturais nos venenos de serpentes da família VIPERlDAE: As RGD-disintegrinas bloqueiam a integrina αIIbβ3 e as ECD-disintegrinas bloqueiam a integrina α2β1. Estas últimas formam parte de metaloproteinases com múltiplos domínios de aproximadamente 50 kDa. Interessados em desenvolver marcadores moleculares para estas integrinas, direcionamos nossos objetivos para: (1) a elucidação da região mínima das ECD-disintegrinas com atividade biológica e (2) construção de biomarcadores para a integrina α2β1 utilizando a região elucidada, e para a integrina αIIbβ3 utilizando uma RGD-disintegrina. Neste trabalho conseguimos determinar uma região de 49 resíduos na porção C-terminal do domínio ECD-disintegrina da jararagina que reage com um anticorpo neutralizante das atividades hemorrágica e de ligação ao colágeno da proteína. Esta região foi subclonada e expressa em fusão com a fosfatase alcalina de E. colí, mas não teve funcionalidade como marcador. No entanto, a RGD-disintegrina eristostatina em fusão com a fosfatase alcalina mostrou bifuncionalidade, apresentando tanto atividade disintegrina como atividade catalítica. Além disso, verificamos sua seletividade pela integrina αIIbβ3 e padronizamos um ensaio direto de dot blot para a presença dessa integrina em plaquetas, com um único passo de incubação. / Integrins are membrane proteins involved in biological processes such as embriogenesis, inflammation and platelet aggregation. The alteration of their expression pattem is related to pathological disorders such as thrombosis and cancer, making integrins suitable indicators of the progression of these diseases. Thus, the α2β1 integrin, which is expressed in endothelial cells during capillary growth, may be an indicator of angiogenesis. The absence of αIIbβ3 integrin in platelets is related to Glanzmann disease, characterized by defective platelet aggregation and its expression in other cellular types is related with metastasis and tissue-invasion processes. These integrins contain natural antagonists in venoms from the VIPERIDAE snake family: RGD-disintegrins, which block the αIIbβ3 integrin and ECD-disintegrins, which block the α2β1 integrin. The latter forming part of multidomain metalloproteinases of approximately 50 kDa. In order to develop molecular markers for integrins, we have directed our objectives at: (1) determining the minimal region of ECD-disintegrins with biological activity and (2) engineering biomarkers for the α2β1 integrin using the previously determined minimal region and for the αIIbβ3 using an RGD-disintegrin. In this work we have determined a 49-residue region located in the C-terminus of jararhagin ECD-disintegrin domain, which reacts with a neutralizing antibody of hemorrhagic and binding to collagen activities of the protein. This region was subcloned and expressed in fusion with E. coli alkaline phosphatase, but did not present a marker activity. On the other hand, the RGD-disintegrin eristostatin fused to alkaline phosphatase showed bifunctionality, presenting both, disintegrin and catalytic activities. Furthermore, we have characterized its selectivity for the αIIbβ3 integrin and we have standardized a direct dot blot assay with one-step incubation for the presence of this integrin in platelets.
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Caracterização de disintegrinas de venenos viperídeos como ferramentas seletivas na detecção ou inibição da função de integrinas / Characterization of viper venom disintegrins as tools for detecting and inhibiting integrin functionDiego Alberto Butera Wadsworth 15 December 2003 (has links)
As integrinas são proteínas de membrana envolvidas em diversos processos biológicos como embriogênese, inflamação e agregação plaquetária. A alteração de seu padrão de expressão está relacionada com processos patológicos como trombose e câncer, fazendo das integrinas ótimos indicadores da progressão destas doenças. Assim, a integrina α2β1 pode ser considerada como indicadora de angiogênese, sendo expressa nas células endoteliais durante o crescimento de novos vasos. Já a ausência da αIIbβ3 em plaquetas está relacionada com a doença de Glanzmann, caracterizada por uma agregação plaquetária deficiente, e sua presença em outros tipos celulares está relacionada com processos de metástase e invasão de tecidos. Estas integrinas contêm antagonistas naturais nos venenos de serpentes da família VIPERlDAE: As RGD-disintegrinas bloqueiam a integrina αIIbβ3 e as ECD-disintegrinas bloqueiam a integrina α2β1. Estas últimas formam parte de metaloproteinases com múltiplos domínios de aproximadamente 50 kDa. Interessados em desenvolver marcadores moleculares para estas integrinas, direcionamos nossos objetivos para: (1) a elucidação da região mínima das ECD-disintegrinas com atividade biológica e (2) construção de biomarcadores para a integrina α2β1 utilizando a região elucidada, e para a integrina αIIbβ3 utilizando uma RGD-disintegrina. Neste trabalho conseguimos determinar uma região de 49 resíduos na porção C-terminal do domínio ECD-disintegrina da jararagina que reage com um anticorpo neutralizante das atividades hemorrágica e de ligação ao colágeno da proteína. Esta região foi subclonada e expressa em fusão com a fosfatase alcalina de E. colí, mas não teve funcionalidade como marcador. No entanto, a RGD-disintegrina eristostatina em fusão com a fosfatase alcalina mostrou bifuncionalidade, apresentando tanto atividade disintegrina como atividade catalítica. Além disso, verificamos sua seletividade pela integrina αIIbβ3 e padronizamos um ensaio direto de dot blot para a presença dessa integrina em plaquetas, com um único passo de incubação. / Integrins are membrane proteins involved in biological processes such as embriogenesis, inflammation and platelet aggregation. The alteration of their expression pattem is related to pathological disorders such as thrombosis and cancer, making integrins suitable indicators of the progression of these diseases. Thus, the α2β1 integrin, which is expressed in endothelial cells during capillary growth, may be an indicator of angiogenesis. The absence of αIIbβ3 integrin in platelets is related to Glanzmann disease, characterized by defective platelet aggregation and its expression in other cellular types is related with metastasis and tissue-invasion processes. These integrins contain natural antagonists in venoms from the VIPERIDAE snake family: RGD-disintegrins, which block the αIIbβ3 integrin and ECD-disintegrins, which block the α2β1 integrin. The latter forming part of multidomain metalloproteinases of approximately 50 kDa. In order to develop molecular markers for integrins, we have directed our objectives at: (1) determining the minimal region of ECD-disintegrins with biological activity and (2) engineering biomarkers for the α2β1 integrin using the previously determined minimal region and for the αIIbβ3 using an RGD-disintegrin. In this work we have determined a 49-residue region located in the C-terminus of jararhagin ECD-disintegrin domain, which reacts with a neutralizing antibody of hemorrhagic and binding to collagen activities of the protein. This region was subcloned and expressed in fusion with E. coli alkaline phosphatase, but did not present a marker activity. On the other hand, the RGD-disintegrin eristostatin fused to alkaline phosphatase showed bifunctionality, presenting both, disintegrin and catalytic activities. Furthermore, we have characterized its selectivity for the αIIbβ3 integrin and we have standardized a direct dot blot assay with one-step incubation for the presence of this integrin in platelets.
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