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Previous issue date: 2011-05-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / Integrins are cell surface receptors that mediate cell adhesion and platelet aggregation, although they do part of important physiological processes in the organism, are also related pathologies such as tumorigenesis, metastasis and thrombosis. Thus integrins are important targets in development of drugs for the treatment of these diseases. Snake venoms metalloproteases (SVMPs) of PII and PIII class possessing a disintegrin domain, capable of binding to integrins inhibiting its activity, have been widely studied for this purpose. PII-SVMPs bind integrins via the RGD motif found in disintegrin domain. PIII-SVMPs have three domains: metalloprotease (M), disintegrin-like (D) with the ECD motif instead of RGD and 'Cysteine-rich' domain (C). PIII-SVMPs containing only DC domains are able to interact with integrins inhibiting cell adhesion and platelet aggregation. However it is not known which region of these molecules is involved in binding to integrins, and two regions are identified as likely responsible for integrin-ligand interactions: the motif ECD and a region called the hyper variable region (HVR) present in some PIII-SVMPs. The intention here was to assist the understanding of this interaction, assessing the importance of ECD motif present in disintegrin-like domain of Bothropasin, a PIIISVMP. For the three-dimensional structure of bothropasin, we have that in the ECD motif, aspartic residue (D) made a interaction with calcium ions, and cysteine (C) is involved in a disulfide bridge, but the glutamic acid (E) which is very reactive, is free to interact with other molecules. Thus, the proposal was to obtain a recombinant molecule consisting in the D and C domains of bothropasin (BDC) and a mutant molecule (BDC-ACD), where the glutamic residue of EDC motif present in disintegrin-like domain of BDC is replaced by a alanine residue. BDC-ACD, was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using the QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, with the DNA template pGEX-4T-BDC and primers containing the desired mutation. The recombinant proteins were expressed in the soluble form in fusion with glutathione Stransferase protein. Purification of recombinants proteins was made in Glutathione Sepharose resin and the fusion proteins, immobilized on the resin were cleaved with enzyme thrombin. BDC and BDC-DCA were evaluated for their ability to inhibition of platelet aggregation which found that the mutation did not cause a significant change in protein activity, indicating that the glutamic residue of ECD motif is not involved in connection with integrins. Were also assayed for inhibition of adhesion of breast adenocarcinoma cells (MDA-MB- 231) to collagen and no inhibition was observed suggesting that, like the other PIII-SVMPs, BDC interact with α2 subunits of intergrins, which are not expressed in tested cells. / As integrinas são receptores de superfície celular capazes de mediar a adesão celular e a agregação plaquetária, que embora façam parte de importantes processos fisiológicos no organismo também estão relacionados a patologias como tumorogênese, metástase e trombose. Deste modo as integrinas constituem importantes alvos no desenvolvimento de drogas para o tratamento dessas doenças. Metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs) das classes PII e PIII por possuírem um domínio desintegrina, capazes de se ligar às integrinas inibindo sua atividade, têm sido amplamente estudadas com esse intuito. PIISVMPS se ligam as integrinas através do motivo RGD que se encontra no domínio desintegrina. PIII-SVMPs possuem três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) que apresenta o motivo ECD invés de RGD, e rico em cisteína (C). PIII-SVMPs contendo apenas os domínios DC são capazes de interagir com integrinas inibindo adesão celular e agregação plaquetária. Contudo não se sabe qual região dessas moléculas está envolvida na ligação às integrinas, sendo que duas regiões são apontadas como prováveis responsáveis pela interação integrina-ligante: o motivo ECD e uma região denominada região hiper variável (HVR) presente em algumas PIII-SVMPs. Foi pretendido aqui colaborar para o entendimento dessa interação, avaliando a importância do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da Botropasina, uma PIII-SVMP. Pela estrutura tridimensional da botropasina, tem-se que no motivo ECD o resíduo aspártico (D) faz uma interação com íon cálcio, e a cisteína (C) está envolvida em uma ponte dissulfeto, porém o glutâmico (E) que é bastante reativo, encontra-se livre para interagir com outras moléculas. Assim, a proposta deste trabalho foi obter a molécula recombinante constituída pelos domínios D e C da botropasina (BDC), e também uma molécula mutante (BDC-ACD), onde o glutâmico do motivo EDC do domínio tipo-desintegrina da BDC foi substituído por um resíduo de alanina. BDC-ACD, foi obtida através de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) com a utilização do QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, tendo como DNA molde pGEX-4T-BDC e primers contendo a mutação desejada. As proteínas recombinantes foram expressas na forma solúvel em fusão com a proteína glutationa S-transferase. A purificação das proteínas recombinantes foi feita em resina Glutathione Sepharose e as proteínas de fusão, imobilizadas na resina, foram clivadas com a enzima trombina. BDC e BDCACD foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibição da agregação plaquetária onde foi verificado que a mutação realizada não alterou significativamente a atividade das proteínas, indicando que o glutâmico do Dissertação de Mestrado de Priscila Tomie Leme Ike vi motivo ECD não está envolvido na ligação com a integrina. Também foram realizados ensaios de inibição da adesão de células de adenocarcinoma da mama (MDA-MB-231) ao colágeno e não houve inibição da adesão celular sugerindo que, assim como outras PIII-SVMPs, a BDC possa interagir com subunidades α2 de intergrinas, que não estavam expressas nas células testadas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6495 |
| Date | 10 May 2011 |
| Creators | Ike, Priscila Tomie Leme |
| Contributors | Souza, Dulcina Maria Pinatti Ferreira de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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