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Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue (DENV) consiste de quatro sorotipos antigenicamente relacionados: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Apesar dos diversos esforços para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue, ainda não há nenhuma comercialmente disponível. As proteínas não estruturais 1 e 3 (NS1 e NS3) são indicadas como antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina contra DENV. Segundo alguns estudos, a proteína NS1 é capaz de induzir uma resposta protetora de anticorpos com atividade de fixação do complemento. A proteína NS3, que realiza reações enzimáticas essenciais para a replicação viral, parece ser imunogênica, contendo um predomínio de epítopos para linfócitos T CD4+ e CD8+. No presente trabalho nós avaliamos o potencial de vacinas de DNA baseadas nas proteínas NS1 e NS3 de DENV-2. Foram construídos cinco plasmídeos, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N e pcTPANS3C, contendo a seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionado ao gene NS3 inteiro ou partes destes. Todos estes plasmídeos mediaram a expressão das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas
Camundongos foram inoculados com estes plasmídeos e desafiados com DENV-2 por via intracerebral (i.c.). Nenhuma destas construções induziu níveis satisfatórios de proteção. Além dos plasmídeos com NS3, foram construídas quatro vacinas de DNA baseadas no gene NS1: 1 - pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E fusionada à NS1, 2 - pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção N-terminal da NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, que codifica o peptídeo sinal t-PA fusionado à NS1 e 4 - pcTPANS1ANC, semelhante ao pcTPANS1 com a adição da seqüência ANC. A proteína NS1 recombinante foi detectada nos extratos celulares e sobrenadante das culturas de células BHK transfectadas com pcTPANS1, pcENS1 e pcENS1ANC. Tais resultados indicam que as seqüências sinais t-PA e E direcionaram a NS1 para secreção. A proteína NS1 também foi observada associada à membrana plasmática de células transfectadas com pcENS1ANC, demonstrando a importância da seqüência ANC para o seu ancoramento. Todos os camundongos imunizados com pcTPANS1 ou pcENS1 produziram altos níveis de anticorpos, direcionados principalmente para epítopos conformacionais da NS1, enquanto que somente metade dos animais inoculados com pcENS1ANC apresentaram níveis detectáveis de anticorpos
A resposta de anticorpos se mostrou duradoura (até 56 semanas após a primeira dose das vacinas), e os animais apresentaram uma rápida resposta secundária após um reforço de DNA. Camundongos imunizados com os plasmídeos pcTPANS1 e pcENS1 se mostraram protegidos contra desafios com DENV-2 por via i.c., sendo o pcTPANS1 levemente mais protetor. Estes dois plasmídeos ativaram a produção de diferentes subclasses de IgG específicas contra NS1. Não foi observada proteção interespecífica quando camundongos imunizados com pcTPANS1 foram desafiados por via i.c. com DENV-1. Os animais imunizados com o pcTPANS1 foram desafiados com DENV-2 por via intraperitoneal e também se mostraram protegidos. Neste modelo de desafio, foi observada uma diminuição dos efeitos histopatológicos do vírus no fígado dos animais vacinados. Resultados preliminares sugerem à lise de células infectadas com DENV-2, dependente do complemento, na presença dos anticorpos direcionados contra NS1 / Dengue virus (DENV) consists of four antigenically related serotypes: DENV-1,
DENV-2, DENV-3 and DENV-4. Although considerable research has been conducted
towards the development of a DENV vaccine, no vaccine is yet commercially available. The
non-structural proteins 1 and 3 (NS1 and NS3) have been identified as promising antigens for
the development of vaccines against DENV. According to some reports, NS1 can elicit a
protective antibody response with complement-fixing activities. NS3, a protein that carries out
enzymatic reactions essential for viral replication, appears to be immunogenic, presenting a
preponderance of the CD4+ and CD8+ T cell epitopes. In the present work we investigate the
potential of DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 and NS3 proteins. We constructed five
recombinant plasmids, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N and
pcTPANS3C, which contain the sequence that codes the signal peptide derived from the
human tissue plasminogen activator (t-PA) fused to the full or partial length of the DENV-2
NS3 gene. Results indicated that these plasmids promoted the expression of recombinant
proteins in eukaryotic cells. Mice were inoculated with these plasmids and challenged by the
intracerebral (i.c.) route with DENV-2. None of these constructs induced acceptable
protection. Moreover, we constructed four DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 gene: 1
- pcENS1, coding the C-terminal of the E protein fused to NS1, 2 - pcENS1ANC, similar to
pcENS1 with the addition of the N-terminal of NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, coding the t-PA
signal sequence fused to NS1 and 4 - pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 with the
addition of the ANC sequence. The recombinant NS1 protein was detected in cell extracts and
culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected BHK cells.
Such results indicated that the E and t-PA sequences targeted NS1 to secretion. NS1 was also
observed in association with plasma membrane of pcENS1ANC-transfected cells, which
demonstrated the importance of the ANC sequence for cell anchoring. High levels of
antibodies, mainly recognizing surface-exposed conformational epitopes of NS1, were
induced in all mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only half of
pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable antibody levels. Long-term antibody
response was observed in pcTPANS1 and pcENS1 immunized animals (56 weeks after the
first vaccine inoculation) and there was a rapid secondary response after a DNA booster.
Protection was elicited in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice challenged with DENV-
2 by the i.c. route and the pcTPANS1 seemed to generate a slightly higher protection.
Moreover, these two plasmids induced different NS1-specific IgG subclasses. No protection
was displayed when pcTPANS1-immunized animals were i.c. challenged with DENV-1.
Animals inoculated with pcTPANS1 were also protected when they were challenged with
DENV-2 by the intraperitoneal route. Liver tissue from vaccinated animals presented a
remarkable decrease of hepatic damages in this challenge mouse model. Preliminary results
suggested the complement-mediated lyses of DENV-2 infected cells in the presence of the
NS1-specific antibody.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12179 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Costa, Simone Morais da |
| Contributors | Rodrigues, Maurício M., Galler, Ricardo, Rumjanek, Vivian M. Barral Dodd, Bonaldo, Myrna Cristina, Borges, Ronaldo da Silva Mohana, Alves, Ada Maria de Barcelos |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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