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Caracterização genômica do sorotipo 1 de vírus dengue isolados no Ceará no ano de 2011 / Genomic characterization of dengue virus serotype 1 isolated on Ceará in 2011

Barboza, Morgana Maria de Oliveira January 2013 (has links)
BARBOZA, Morgana Maria de Oliveira. Caracterização genômica do sorotipo 1 de vírus dengue isolados no Ceará no ano 2011. 2013. 72 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-10T11:37:37Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmobarboza.pdf: 1876515 bytes, checksum: 7026424df2d177ca45a9f68426e91861 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-06-13T12:30:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmobarboza.pdf: 1876515 bytes, checksum: 7026424df2d177ca45a9f68426e91861 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T12:30:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mmobarboza.pdf: 1876515 bytes, checksum: 7026424df2d177ca45a9f68426e91861 (MD5) Previous issue date: 2013 / O vírus da dengue (VDEN) é responsável pela principal arbovirose da atualidade. As manifestações clínicas da dengue variam amplamente e uma das hipóteses que tentam explicar a gravidade da doença se concentra em variações genéticas nos vírus. Os VDEN são classificados em quatro sorotipos antigenicamente distintos e desde a década de 80 são observadas variações dentro dos sorotipos, posteriormente subdivididos em genótipos. No Brasil, apenas um genótipo de VDEN-1 circula no país. Sua introdução no Estado do Ceará, em 1986, provocou diversas epidemias. Após um silêncio epidemiológico, este sorotipo volta a circular no Estado e, em 2011, é responsável por uma das maiores epidemias registradas, coincidindo com o aumento do número de casos graves de dengue e mudanças no padrão epidemiológico da doença. É neste cenário que realizamos a caracterização molecular de isolados de VDEN-1 no Estado do Ceará no ano de 2011. Foi extraído o RNA do vírus de trinta e três (33) amostras de soro de pacientes sabidamente positivos para dengue, confirmados por isolamento viral seguido por imunofluorescência. Primers delimitando a região de junção E/NS1 foram utilizados para amplificação por RT-PCR em única etapa. O sequenciamento foi realizado no ABI Prism 3130 (Biosystems). As sequências geradas foram analisadas e editadas nos programas Gap4, Trev e MEGA v.5. Para o alinhamento múltiplo que incluía outras sequências de VDEN-1 isolados no Brasil e no mundo foi usado o programa Muscle. Na análise filogenética utilizamos os métodos de Neighbor-Joining (NJ), Máxima Verossimilhança (MV), Máxima Parsimônia (MP) e Inferência Bayesiana, após definição do modelo evolutivo utilizando o programa JModeltest. O resultado da análise da região de junção E/NS1 de 17 sequências de VDEN-1 isolados em 2011 mostrou diversas mutações no terceiro códon, com 3 substituições sinônimas e uma não-sinônima (The:Ala).A árvore gerada pelo método Bayesiano mostrou três linhagens distintas de VDEN-1 no Ceará. / Dengue virus (DENV) is responsible for leading arboviral today. The clinical features of dengue fever vary widely and one of the hypotheses that attempt to explain the severity of the disease focuses on genetic variation in viruses. The DENV are classified into four antigenically distinct serotypes and since the 80’s is observed variation within serotypes, further subdivided into genotypes. In Brazil, only one genotype DENV-1 circulating in the country. Its introduction in the state of Ceara, in 1986, caused several epidemics. After an epidemiological silence, this serotype return at state and, in 2011, is responsible for one of the biggest epidemics recorded, coinciding with the increase in the number of severe cases of dengue and changes in the epidemiological pattern of the disease. It is in this scenario that we perform molecular characterization of isolates of DENV-1 in the state of Ceara in 2011. RNA was extracted from virus of thirty-three (33) serum samples from patients known to be positive for dengue, confirmed by virus isolation followed by immunofluorescence. Primers delimiting the E/NS1 junction region were used for amplification by RT-PCR in a single step. Sequencing was performed on the ABI Prism 3130 (Biosystems). The sequences generated were analyzed and edited in programs Gap4, Trev and MEGA v.5. For the multiple alignment that included other sequences DENV-1 isolates in Brazil and the world was using the program Muscle. In phylogenetic analysis methods used Neighbor-Joining (NJ), Maximum Likelihood (ML), Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference, after defining the evolutionary model using the program JModeltest. The result of the analysis of E/NS1 junction region of 17 DENV-1 sequences isolated in 2011 showed several mutations in the third codon with three synonymous and one non-synonymous (The:Ala) replacements. The tree generated by the Bayesian method showed three distinct lineages of DENV-1 in Ceara.
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Presença de anticorpos contra um peptídeo conservado do envelope do dengue vírus em soro humano

Rocha, Mariana Maraschin da January 2016 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340462.pdf: 1505088 bytes, checksum: a16e2e2d9a9e92fde60d1010eb026ecc (MD5) Previous issue date: 2016 / A dengue é considerada um grande problema de saúde pública em regiões tropicais e subtropicais do mundo. O principal alvo de anticorpos para o vírus da dengue (DENV) é a proteína do envelope (E). Áreas da proteína E que são conservadas estruturalmente e funcionalmente podem ser alvos de anticorpos neutralizantes contra os quatro sorotipos. Dados de bioinformática da proteína E do DENV identificaram a presença de um peptídeo altamente conservado na estrutura de todos os quatro sorotipos virais, localizado no E-DII da proteína viral. O peptídeo E250-270 constitui a maior porção conservada e é exposto na conformação trimérica da proteína E. Acredita-se que anticorpos direcionados contra ele possam ser neutralizantes. O presente trabalho avaliou a presença de anticorpos anti-E250-270 em soro de pacientes infectados. Para tanto, um ELISA indireto contra E250-270 foi desenvolvido. Inicialmente foram expressas as proteínas GST e KLH fusionadas ao peptídeo e ambas foram utilizadas como antígenos de imunização para obtenção de anticorpo monoclonal contra o E250-270. Para o ELISA indireto, foram selecionadas 82 amostras, 54 positivas para dengue (DV) e 28 de doadores saudáveis. A área sob a curva (ASC) foi calculada para cada amostra através de uma leitura cinética de 30 minutos (DO 450 nm) e a curva ROC foi construída visando o critério de máxima sensibilidade e especificidade. Os grupos testados diferiram entre si em relação à média da ASC (t = - 2,9722, df = 80, p = 0,0039). O ponto de corte sugerido pela curva ROC foi de 10,386, com sensibilidade de 59,2 % e especificidade de 64 %, VPP = 74,4 % e VPN = 45,0 %. Entre as amostras positivas para DV, 34 delas ficaram acima do ponto de corte, indicando a presença de anticorpos IgG anti E250-270. Entre os doadores saudáveis, 10 amostras ficaram acima do ponto de corte, entretanto foi verificado que sete delas haviam sido vacinadas contra a febre amarela, que também é um Flavivirus. Isso pode explicar o reconhecimento de E250-270, uma vez que existem similaridades entre as sequências do peptídeo com a sequência do vírus atenuado da vacina. Dessa forma, o estudo demonstrou a presença de anticorpos contra E250-270 em amostras positivas para DV. Estudos futuros poderão correlacionar a presença desses anticorpos com gravidade ou proteção da doença. <br> / Abstract : Dengue represents a large-scale public health problem in tropical and subtropical regions of the world. The main target of antibodies against dengue virus (DENV) is the envelope protein (E). Structurally and functionally preserved regions of the E protein can be target of neutralizing antibodies against all four serotypes. Bioinformatics data on the E protein of DENV identified the presence of a highly conserved peptide in all four serotypes structure located on the E-DII of the viral protein. E250-270 peptide is the most conserved portion of the E protein and is exposed in its trimeric conformation. It is thought that antibodies directed against it might be neutralizing. Therefore, this study evaluated the presence of anti-E250-270 antibodies in serum of infected patients through an indirect ELISA. E250-270 fused to GST and KLH proteins were expressed and used as immunizing antigens to obtain monoclonal antibodies against E250-270. For indirect ELISA, we selected 82 samples, 54 positive for dengue (DV) and 28 healthy donors. The area under the curve (AUC) was calculated for each sample from kinetic readings up to 30 minutes (OD 450 nm) and a ROC curve was built using maximum sensitivity and specificity criteria. Tested groups differed among each other in comparison to AUC mean (t = - 2.9722, df = 80, p = 0.0039). The suggested cut-off point for the ROC curve was 10.386, with a sensitivity of 59.2 % and specificity of 64 %, PPV = 74.4 % and NPV = 45.0 %. Among positive samples for DV, 34 of them were above the cut-off point, indicating the presence of IgG antibodies anti- E250-270. Among healthy donors, 10 samples were above the cut-off; however, seven of them had been vaccinated against yellow fever, which is also caused by a Flavivirus and has a similar peptide sequence. Thus, the study showed the presence of antibodies against E250-270 in positive samples for DV. Future studies could correlate the presence of these antibodies with gravity or protection against the disease.
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Caracterização molecular de vírus do dengue sorotipo-1 e desenvolvimento de cDNA infeccioso

Carvalho, Sandra Elisa de Sousa 16 December 2009 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-05-30T22:18:31Z No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Dengue é uma importante arbovirose causada pelo vírus do dengue (DENV; Família Flaviviridae, Gênero Flavivirus). Notável aumento no número de casos de dengue e dengue hemorrágica foi registrado nas Américas. Neste estudo foi descrito a diversidade de sequências de diferentes genomas completos de DENV-1 e a inferência filogenética de vírus isolados na América. Dois isolados brasilienses (Distrito Federal, Brasil) de DENV-1 foram identificados em testes utilizando anticorpo policlonal e monoclonal. Os vírus foram amplificados in vitro em células C6/36 de Aedes albopictus. O RNA genômico desses isolados (DF01 e DF02) foram amplificados usando pares de oligonucleotídeos específicos para DENV-1 por RT-PCR. O genoma foi dividido em três fragmentos de cDNA que se sobrepõem e os cDNA amplificados foram clonados em pCR4-TOPO. O DNA plasmidial foi purificado e a sequência de nucleotídeos determinada. DF01 e DF02 foram completamente sequenciados e suas sequências comparadas a um grupo de dados representativo da diversidade genotípica americana de DENV-1 e a um isolado de Singapura, geneticamente distinto dos genótipos de circulação americana. Embora sejam observadas consideráveis diferenças em sequências de aminoácidos presentes em regiões importantes, vários elementos chaves (sítios de glicosilação, pontes disulfeto e sequências características a domínios funcionais de proteínas) foram completamente conservados. Análises filogenéticas indicaram a existência de um grupo monofilético dividido em dois sub-grupos na população de DENV-1 circulante na América Latina, relacionando a sua distribuição geográfica. Foram descritos três potenciais eventos de recombinação entre os isolados analisados, um destes ocorreu no novo vírus identificado DF01. Nossas análises de sequências genômicas completas de populações geograficamente estruturadas e com baixa diversidade na América Latina produziram forte evidência de recombinações relativamente difundidas. Os clones obtidos com fragmentos genômicos de DENV-1 utilizados no estudo, foram transferidos para um vetor modificado para o possível desenvolvimento de cDNA infeccioso. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dengue is an important arboviral disease caused by dengue viruses (DENV; Family Flaviviridae, Genus Flavivirus). A dramatic increase in the number of dengue fever and hemorrhagic dengue cases had been reported in the American continent. In this work we describe the diversity found in full-length DENV-1 sequences and phylogenetic inference of dengue virus isolated in Americas. Two DENV-1 isolates form Brasília (Federal District, Brazil), were identified using polyclonal and monoclonal antibody-assay. The viruses were amplified in vitro in an Aedes albopictus C6/36 cell line. Genomic RNA of those isolates (DF01 e DF02) were amplified using specific primer pairs for DENV-1 by RT-PCR. The genome was divided into three overlapping cDNA fragments, and amplified cDNA was linked into pCR4-TOPO. Plasmid DNA was purified and nucleotide sequences were determined. DF01 and DF02 were completely sequenced and compared to a data set of full genomic sequence of DENV-1, that represent the genotypic diversity of this serotype, and one sequence from Singapura, used as outgroup. Although our genetic analyses revealed considerable differences at protein levels, several key elements (i.e. disulfide bridges, glycosylation sites and protein functional domains) were fully conserved. Phylogenetic analysis indicated the existence of one monophyletic Latin American cluster (LA) which could in turn be divided into two major sub-clusters, characterized by a geographical subdivision. We found three recombination events among all DENV examined sequences, one of the new full length genome described here was apparently recombinant. Our analysis of full genome sequences samples of DENV-1 population geographically structured and with low-diversity in Latin American has yielded strong evidence of relatively pervasive recombination. The clones obtained with DENV-1 subgenomic fragments used in this study, were transferred into lowcopy plasmid modified for the possible construction of an infectious cDNA clone.
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Diferenças na variação da competência vetorial entre nove populações de Aedes aegypti do munícipio de Belo Horizonte, Minas Gerais, ao Dengue virus 2

Gonçalves, Caroline Macedo January 2014 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T17:01:38Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolineMacedoGoncalves-pdf.pdf: 1566062 bytes, checksum: e805bc24ca1900f82d5004ef6cd9058a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T17:01:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolineMacedoGoncalves-pdf.pdf: 1566062 bytes, checksum: e805bc24ca1900f82d5004ef6cd9058a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T17:02:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolineMacedoGoncalves-pdf.pdf: 1566062 bytes, checksum: e805bc24ca1900f82d5004ef6cd9058a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T17:02:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarolineMacedoGoncalves-pdf.pdf: 1566062 bytes, checksum: e805bc24ca1900f82d5004ef6cd9058a (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / No Brasil, as epidemias de dengue ainda estão difundidas por todo o país. Além da falta de conhecimento de como os surtos da doença são capazes de iniciar e sustentar o seu ciclo de transmissão, existem poucos estudos avaliando a habilidade das populações brasileiras de A. aegypti para transmitir o vírus. O objetivo do nosso estudo foi comparar a susceptibilidade de A. aegypti capturados nas nove regionais de Belo Horizonte, ao DENV-2, nos anos de 2009 e 2011. Para tal finalidade, parâmetros como a taxa de infecção (IR), competência vetorial (CV) e a taxa de infeção disseminada (DIR) foram determinadas. Os ovos dos A. aegypti de cada regional foram coletadas separadamente e colonizados em um insetário. As fêmeas adultas foram infectadas experimentalmente com DENV-2 e o vírus foi detectado através da RT-qPCR nas amostras dos corpos e cabeças dos mosquitos. Os dados foram analisados através do programa estatístico Social Sciences – versão 17. A IR variou de 40% a 82,5% em 2009 e de 60% a 100% em 2011. A CV variou de 25% a 77,5% em 2009 e de 25% a 80% em 2011. Já a DIR oscilou de 68,7% a 100% em 2009 e 38,4% a 86,8% em 2011. Os resultados foram avaliados por um modelo logístico utilizando IR como co-variável. Em 2009, as regionais Norte, Barreiro, Centro-Sul e Venda Nova mostraram uma forte associação. Em 2011, uma forte associação foi observada entre as regionais Centro-Sul, Venda Nova, Oeste e Nordeste. Utilizando a competência vetorial com co-variável, em 2009, as regionais Centro-Sul e Venda Nova apresentaram associação mais relevante. Já em 2011, as regionais Centro-Sul, Venda Nova e Barreiro apresentaram associação significativa. Quando os dados de DIR foram analisados pelos modelos de regressão logística, Pampulha, Centro-Sul, Venda Nova, Oeste, Nordeste e Leste 2009), bem como, Centro-Sul, Venda Nova e Oeste (2011) foram as regionais que apresentaram a associação mais forte. Concluí-se que as populações de A. aegypti de Belo Horizonte exibiram ampla variação na sua competência vetorial para transmitir DENV-2. Por isso, dados e estratégias de controle do vetor, de cada uma das regionais, precisam estar disponíveis para os órgãos competentes. Análises futuras precisam ser desenvolvidas para um melhor entendimento das razões pelas quais ocorre esta grande variabilidade na CV e como estes parâmetros se correlacionam com os achados epidemiológicos dos anos seguintes. / In Brazil, dengue epidemics are still diffusing throughout the country and it is unclear if outbreaks may initiate a sustainable transmission cycle. There are few studies evaluating the ability of Brazilian Aedes aegypti populations to transmit the virus. The aim of this study was to compare the DENV susceptibility of field-captured Ae. Aegypti populations from nine distinct geographic areas of the city of Belo Horizonte in 2009 and 2011. Parameters as Infection Rate (IR), Vector Competence (VC) and Disseminated Infection rate (DIR) were determined. Aedes aegypti eggs from each region were separately collected and hatched in an insectary. Adult females were experimentally infected with DENV-2 and the virus was detected by qPCR in body and head samples. Data were analyzed with the Statistical Package for the Social Sciences version 17. IR varied from 40% to 82.5% in 2009 and 60% to 100% in 2011. VC ranged from 25% to 77.5% in 2009 and 25% to 80% in 2011. DIR oscillated from 68.7% to 100% in 2009 and 38.4% to 86.8 in 2011. The results were evaluated by a logistic model using IR as covariate. In 2009, North, Barreiro, Central South and Venda Nova showed the strongest association. In 2011, the same was observed for Central South, Venda Nova, West and Northeast regions. Using VC as covariate, in 2009, Central South and Venda Nova showed the most relevant association. In 2011, Central South, Venda Nova and Barreiro presented the most revelation association. When DIR data were analyzed by logistic regression models, Pampulha, Central South, Venda Nova, West, Northeast and East (2009) as well as Central South, Venda Nova and West (2011) were the districts showing the strongest association.We conclude that A. aegypti populations from Belo Horizonte exhibit wide variation in vector competence to transmit dengue. Because of it, vector control strategies should match the available data for each region. Further analysis should be conducted to better understand the reasons for this large variability of vector competence and how these parameters correlate with epidemiological findings in the following years.
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Imunidade inata ao vírus da dengue: um estudo do interferon do tipo I / Innate immunity to dengue virus: a study of the type I interferon

Silva, Mayara Marques Carneiro January 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2013mayara-mmc.pdf: 1411074 bytes, checksum: 2521ca963e0a676d61e1a93252efa84f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A febre da dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue (FHD) têm emergido como as mais importantes doenças causadas por arbovírus em áreas tropicais. A forma mais grave da doença, a FHD, apresenta taxa de mortalidade geralmente entre 1 por cento e 10 por cento e requer hospitalização e um cuidadoso controle hemodinâmico dos pacientes. O interferon do tipo I (IFN-I), IFN-alfa/beta, juntamente com o IFN tipo do II (IFN-II), IFN-gama, são fundamentais na mediação da resposta antiviral, através da modulação da resposta imune para inibir a propagação viral. No presente trabalho, propomos o estudo da resposta imune inata ao vírus da dengue (DENV), com ênfase no IFN-I. Para isso, investigamos os níveis de expressão dos genes que codificam os IFN-I e IFN-II, utilizando cDNA, obtido de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes infectados com o DENV, através do sistema de PCR em tempo real (qPCR), e analisamos os níveis de IFN-I no soro dos mesmos pacientes pelo ELISA. Avaliamos, também, a via de sinalização do IFN-I em células infectadas por diferentes cepas do DENV, utilizando a linhagem celular BHK21pISRELucHygro, que possui em seu genoma um plasmídeo que contém como promotor o ISRE (região responsiva ao IFN-I) fusionado ao gene repórter luciferase. A quantificação do IFN-I das PBMCs, por qPCR, mostrou que os pacientes acometidos com a FHD, com até 5 dias de febre, expressaram níveis mais elevados do IFN-I quando comparados aos pacientes acometidos pela FD. Enquanto, os níveis séricos de IFN-alfa dos pacientes FD e FHD, quantificados através do ELISA, mostraram níveis similares, representando um padrão diferente do observado nos transcritos de IFN-I em PBMCs. No entanto, os níveis séricos de IFN-gama foram significativamente maiores em pacientes FHD, confirmando o padrão observado na quantificação por qPCR / Por fim, na análise da via de sinalização do IFN-I via expressão da luciferase em células BHK21pISRELucHygro após infecção por diferentes cepas do DENV foi observado que esses isolados clínicos possuíram a capacidade de inibir a via em diferentes proporções
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Caracterização dos efeitos imunomodulador e antiviral de uma espécie da família marcgraviaceae em modelo in vitro de infecção em linhagem de hepatócitos HUH-7 pelo vírus dengue-2

Fialho, Luciana Gomes January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luciana_fialho_ioc_mest_2012.pdf: 8648781 bytes, checksum: 436f2afe55001d26518f8d1e0a52d7f0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Várias doenças relacionadas à desregulação do sistema imunológico têm sido, há muito tempo, tratadas com a medicina fitoterápica, considerando que vários efeitos terapêuticos podem ser induzidos pela modulação de citocinas. Entretanto, não são encontrados relatos científicos do uso de plantas medicinais na dengue. A identificação de compostos com propriedades imunomoduladoras é extremamente importante para o tratamento da dengue, uma vez quea gravidade da doença está relacionada a uma produção exacerbada da resposta imunológica, principalmente, de citocinas que podem levar à distúrbios hemodinâmicos e de coagulação. A família Marcgraviaceae, pertencente à flora brasileira, tem sido avaliada quanto às suas atividades biodinâmicas, devido ao seu quase completo ineditismo químico e farmacológico. A atividade anti-inflamatória dessa família tem sido descrita por alguns autores. Assim sendo, o objetivo principal do trabalho foi caracterizar os potenciais antivirais e imunomoduladores de uma espécie de Marcgraviaceae. Foi estabelecido e utilizado um modelo in vitrocultivando uma linhagem de hepatócitos \2013 as células HuH-7- que foram infectadas com DENV-2 As células HuH-7 infectadas foram incubadas, por 48 horas, com uma fração butanólica e 4 subfrações (26-30, 40-43, 89-98 e 99-134) derivadas de um extrato bruto etanólico de folhas de uma espécie de Marcgraviaceae. As amostras passaram por uma triagem, a qual identificou a atividade antiviral das mesmas, através da detecção do antígeno viral (DENV Ag) nas células HuH-7, pela citometria de fluxo e a atividade imunomoduladora, através da dosagem de MIF, por ELISA, no sobrenadante das culturas infectadas e tratadas. Os resultados da triagem indicaram que a fração butanólica e sua subfração 89-98 apresentaram ambasas atividades, sendo selecionadas para os demais estudos de caracterização dos mecanismos de ação. Após a seleção, a atividade antiviral destas frações/subfrações foram avaliadas quanto à produção de óxido nítrico (NO), através dareação de Griess, e detecção da proteína viral NS1, através de ELISA. A ação imunomoduladora foi avaliada através da dosagem de IL-8 também por ELISA. Nossosresultados demonstraram que a fração butanólica e sua subfração 89-98, foram capazes de reduzir a taxa de produção de NS1, além de estimular a produção de NOpelas células HuH-7 Além disso, a subfração 89-98 também reduziu a produção de IL-8. Em conclusão, acreditamos que estas frações/subfrações sejam boascandidatas para o desenvolvimento de fitoterápicos a serem usados no tratamento da dengue. Considerando que o organismo é capaz de controlar ainfecção por DENV em poucos dias e que as reações imunológicas possuem um papel importante na patogênese da dengue, o estudo de fatores imunomoduladores é uma abordagem de investigação inovadora e relevante / Various diseases related to immunodesregulation have been long treated by herbal medicine, considering that several therapeutical effects are observed in the modulation of cytokines. However, there are few reports regarding to the use of medicinal plants in dengue. The identification of compounds with immunomodulatory properties is extremely important for the treatment of dengue, since the disease severity is related to an exacerbated production of the immunological response, mainly cytokines that may lead to hemodynamic and coagulation disorders. Marcgraviaceae, a family of the Brazilian flora, has been evaluated for its biodynamic activities, due to its almost complete chemical and pharmacological uniqueness. The anti-inflammatory activity of this family has been described by some authors. Therefore, the aim of this work was to characterize the antiviral and immunomodulator potentials of a Marcgraviaceae species. It was established and used an in vitro model cultivating an hepatocyte cell line – HuH-7 cells – that were infected with DENV-2. Infected, HuH-7 cells were incubated with a buthanolic fraction and four subfractions ((26-30, 40-43, 89-98 e 99-134) derived from a crude ethanol leave extract from a Marcgraviaceae species, for 48 hours. The samples went through a screening that revealed their antiviral activity, by detection of viral antigen (Ag DENV) in HuH-7 cells, using flow cytometry.The immunomodulator activity was measured by ELISA detecting MIF levels in the supernatant of infected and treated cultures. The results of screening indicated that the buthanolic fraction and its subfraction 89-98 presented both activities, being selected for the other studies to characterize the mechanisms of action. After selection, the antiviral activity of these fractions/subfractions were evaluated for the production of nitric oxide (NO) by Griess reaction, and viral protein NS1 detection, by ELISA. The immunomodulator action was evaluated by IL-8 measurement by ELISA as well. Our results demonstrated that the buthanolic fraction and its subfraction 89-98 were able to reduce NS1 production ratio, besides stimulating NO production by HuH-7 cells. Furthermore, the 89-98 subfraction also reduced IL-8 production. In conclusion, we believe that these are good candidates for the development of herbal medicines for the treatment of dengue. Considering that the host is able to control infection by DENV in a few days and that immune responses develop an important role in the pathogenesis of dengue, the study of immunomodulatory factors is a relevant approach in research.
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Avaliação do perfil de mediadores séricos e proteínas intraplaquetárias em relação à plaquetopenia em pacientes infectados pelo vírus dengue

Barros, Tamiris Azamor da Costa January 2015 (has links)
Made available in DSpace on 2015-11-04T13:29:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tamiris_barros_ioc_mest_2015.pdf: 3974773 bytes, checksum: 582ff742d19972a2ff51fc3e5895c17f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Plaquetas são fragmentos celulares derivados dos megacariócitos, que desempenham papel na hemostasia, coagulação, angiogênese, inflamação e resposta imune. Na infecção humana pelo Vírus Dengue (DENV), plaquetas constituem uma das populações celulares mais afetadas devido à plaquetopenia e disfunção plaquetária. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de citocinas, quimiocina e fatores de crescimento séricos e de proteínas intraplaquetárias relacionadas à angiogênese, coagulação, regulação da matriz extracelular e inflamação na plaquetopenia de pacientes infectados pelo DENV. Para tal, realizamos: (i) estudo populacional de pacientes e obtenção de soro e plaquetas em 2013, (ii) ensaios multiplex de micrarranjo líquido para quantificação dos níveis séricos de citocinas, quimiocina e fatores de crescimento e (iii) ensaio de determinação do perfil de expressão 55 proteínas intraplaquetárias. Quarenta e três pacientes DENV foram confirmados, com predominância do DENV-4. Independente da forma clínica, pacientes DENV apresentaram níveis séricos elevados de IL-10, TNF-\03B1, CXCL8/IL-8, mas não de IL-1\03B2 e IFN-\03B3 quando comparados aos controles sadios. Análises estatísticas demonstraram que níveis de IL-10 e IFN-\03B3 apresentaram correlação, respectivamente inversa e direta com a contagem de plaquetas. Ainda, IL-10 diretamente com leucócitos e linfócitos e TNF-\03B1 com linfócitos Vinte e cinco proteínas intraplaquetárias foram quantificadas, mas apenas cinco delas, PDGF-AA, TGF-\03B21, HGF, IGFBP-1 e Angiopoetina-1, apresentaram correlação direta com a contagem de plaquetas nos pacientes DENV. A quantificação sérica de PDGF e VEGF demostrou que ambos estavam diminuídos no grupo DENV mais trombocitopênico. Análise entre proteínas intraplaquetárias com funções biológicas antagônicas demonstraram que a razão anti- versus pró-inflamatórios TGF-\03B21/MIP-1\03B1 foi diminuída em pacientes DENV trombocitopênicos e as razões anti versus pró-angiogênica serpina F1/angiopoetina-1 e serpina F1/ PDGF-AB/BB apresentaram níveis aumentados em pacientes DENV trombocipênicos. Concluímos brevemente que a reintrodução do DENV-4 não resultou numa maior ocorrência de gravidade. Contudo esta reintrodução, induziu aumento dos níveis de TNF-\03B1 e CXCL8/IL-8 e da IL-10, influenciando de maneira direta ou indireta contagens de plaquetas e/ou demais células em resposta à infecção. Níveis IX intraplaquetários de PDGF, TGF-\03B21, IGFPB-1, Angiopoetina e HGF em pacientes mais trombocitopênicos poderiam prejudicar a ativação de mecanismos relacionados à angiogênese, coagulação, integridade do endotélio vascular e produção de mediadores inflamatórios. Assim, plaquetas poderiam ser consideradas células atuantes da resposta imunológica anti-DENV e, portanto, plaquetopenia é um fator prognóstico chave da imunopatogênese da dengue / Platelets are cell fragments derived from megakaryo cytes, which play a role in hemostasis, coagulation, angiogenesis, inflammation and immune response. In human infection with dengue virus (DENV), platelets are one of the most affecte d cell populations due to thrombocytopenia and platelet dysfunction. The objective of this stu dy was to investigate the influence of serum cytokines, chemokines, intraplatelet growth factors and proteins related to angiogenesis, coagulation, regulation of extracellular matrix and inflammation in thrombocytopenia of patients infected with DENV. For this purpose, we conducted: (i) population study of patients and obtaining their serum and platelets in 2013, (ii) l iquid microarray multiplex assays for quantitation of serum levels of cytokines, chemokine, and growth factors, and (iii) assay for determining expression profile of 55 intraplapletelet proteins. Forty-three DENV patients were confirmed, with a predominance of DENV-4. Regardless of type o f DENV, levels of IL-10, TNF- α , CXCL8 / IL-8, but not IL-1 β and IFN- γ were higher on serum of patients compared to healt hy individuals. Statistical analyses showed that levels of IL-10 an d IFN- γ presented correlation, respectively, inverse and direct with platelet count. Furthermore , IL-10 was directly correlated with leukocytes, lymphocytes, TNF- α and with lymphocytes. Twenty-five intraplatelet pr oteins were quantified, but only five of them, PDGF-AA, TGF- β 1, HGF, angiopoietin-1 and IGFBP-1 were directly correlated with platelet count in DENV pat ients. Both levels of PDGF and VEGF were decreased in group of DENV thrombocytopenic. Analys es between intraplatelet proteins with antagonic biological functions have shown that rati os anti- versus pro-inflammatory TGF- β 1 / MIP-1 α were decreased in thrombocytopenic DENV patients a nd the ratios anti-versus pro- angiogenic serpin-F1 / angiopoietin-1 and serpin-F1 / PDGF-AB / BB showed increased levels in thrombocytopenic DENV patients. Briefly been con cluded that the reintroduction of the DENV- 4 did not result in a higher incidence of gravity. However, levels of TNF- α and CXCL8 / IL-8 and IL-10 were increased, influencing directly or indir ectly platelet counts and/or other cells in response to infection. Levels of PDGF, TGF- β 1, IGFPB-1, angiopoietin and HGF intraplatelet of patients high thrombocytopenic may impair activatio n of mechanisms related to angiogenesis, coagulation, vascular endothelial integrity and pro duction of inflammatory mediators. Thus, platelets might be considered active anti-DENV immu ne response cells and hence thrombocytopenia is a key prognostic fator in the i mmunopathogenesis of dengue.
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Interação vírus-vetorcaracterização da região 3\2019 não-codificante (NC) de vírus dengue tipo 3 (DENV-3), isolados de mosquitos e humanos, após a infecção experimental sucessiva e simultânea em mosquitos

Carneiro, Thaís Chouin January 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2015-11-04T13:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thais_carneiro_ioc_mest_2014.pdf: 1876010 bytes, checksum: 1e2c6b5de2029c4c9787f8070f8c3d9e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é considerada a mais importante das doenças virais transmitida por artrópodes que acomete o homem. O vírus dengue (DENV) é mantido na natureza através de replicação cíclica em hospedeiros vertebrados e mosquitos Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. O seqüenciamento completo de DENV-3 isolado de Ae. aegypti naturalmente infectado do Rio de Janeiro em 2001 e de um caso humano em 2002, demonstrou uma similaridade de 99% com DENV-3 isolado de um caso fatal humano ocorrido no mesmo período. A análise da região 3´NC do genoma viral demonstrou uma mutação nesta região, sugerindo uma deleção de 8 nucleotídeos (nts) na inserção de 11nts, característica de DENV-3 isolados no Brasil. Neste estudo, avaliamos se as diferentes variantes de DENV-3 na interação vírus-vetor através da determinação da competência vetorial em Ae. aegypti. As cepas de DENV-3 BR74886 #5 (cepa representativa do vírus com inserção de 11nts na região 3\2019NC) e BR73356 #5 (cepa representativa do vírus com a deleção de 8 nts), apresentando títulos de 8 x 107 PFU/mL e 7,3 x 107 PFU/mL, respectivamente, mantiveram suas características na região 3\2019NC do genoma viral após cinco passagens em cultura celular e foram selecionadas para a infecção experimental. A estratégia de infecção consistiu na utilização de 2.925 fêmeas de Ae. aegypti, sendo que 2.340 da geração F1 da população de Tubiacanga (RJ) e 585 da cepa controle Paea A população experimental se mostrou competente para transmitir as duas cepas virais de DENV-3, no entanto a disseminação viral no corpo do mosquito apresentou-se de forma heterogênea, sugerindo haver vantagens para a cepa com inserção de 11 nts, uma vez que disseminou-se mais rapidamente. Quando as fêmeas de Ae. aegypti foram alimentadas com ambas as cepas, a disseminação no vetor comportou-se de maneira semelhante à observada quando alimentadas com a cepa representativa da inserção de 11 nts. A análise das cepas de DENV-3 detectadas nas cabeças das fêmeas após replicação in-vivo por 14 dias, não identificou alterações nas características de cada cepa. No entanto, a análise desta região demonstrou uma prevalência do vírus com a inserção de 11 nts quando as fêmeas foram alimentadas com as duas cepas simultaneamente. Variações entre os títulos virais foram observados nas salivas de fêmeas infectadas com as diferentes cepas virais, sugerindo que embora ambas as cepas de DENV-3 possam ser transmitidas na natureza, a cepa com a inserção de 11 nts possui maior eficácia. Os resultados indicam que diferentes cepas virais, variantes genéticas ou mutações que ocorram em um mesmo genótipo podem impactar na competência vetorial dos mosquitos, podendo afetar diretamente o potencial epidêmico de uma cepa de vírus em particular / Dengue is considered the most important arthropod - borne viral disease that affects humans. Dengue virus (DENV) is maintained in nature by a cyclic replication in vertebrate hosts and Aedes mosquitoes, with the Aedes aegypti as the main vector. The complete sequencing of a DENV - 3 strain isolated from Ae. aegypti naturally infected in Rio de Janeiro in 2001 and from a h uman case occurred in 2002 demonstrated a similarity of 99% with a DENV - 3 isolated from a human fatal case occurred in the same period. However, the analysis of the 3 Untranslated Region (UTR) of the viral genome showed a mutation in this region, suggestin g a deletion of 8 nucleotides (nts) within the 11 nucleotides insertion, characteristic of DENV - 3 isolated in Brazil. In this study, we evaluated whether the distinct DENV - 3 variants presenting those characteristics showed differences on the virus - vector i nteraction by determining the vector competence of two populations of Ae. aegypti . The DENV - 3 strain BR74886#5 (with the 11nts insert in the region 3' UTR ) and the strain BR73356#5 (with an 8 nts deletion), presented titers of 8 x 10 7 PFU/mL and 7.3 x 10 7 PF U/mL, respectively, maintained its characteristics in the 3' UTR region of the viral genome after five passages in cell culture and were selected for experimental infection. The infection strategy consisted in the use of 2,925 female Ae. a egypti : 2,340 of a F1 generation from the Tubiacanga (RJ) population and 585 Paea control mosquitoes. The experimental population proved to be competent to transmit the two DENV - 3 strains. However, the viral dissemination in the body of the mosquito presented heterogeneousl y, suggesting that there are advantages for the strain with 11 nts insertion in the 3' UTR , once disseminated more rapidly . When Ae. aegypti were fed with the both strains, the viral dissemination in the vector was similar to that observed when fed with 11 nts insertion in the 3' UTR . The analysis of the 3' UTR from the DENV - 3 strains detected in the heads of females after in - vivo replication for 14 days, did not identify changes in the 3’ UTR of each strain. However, the analysis of the females infected with two strains simultaneously detected only the presence of the strain carrying the 11 nts insertion in the 3' UTR . Viral titer differences were observed in the saliva of the experimentally infected Ae. a egypti females suggesting that even tough both variants are transmissible, the variant presenting the 11nts is more efficiently transmitted. The results indicate that different viral strains, genetic variants or mutations that occur in the same genotype may impact on the vector competence of mosquitoes, which c an directly affect the epidemic potential of a particular virus strain
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Vinte e cinco anos de DENV-1 no Brasilepidemiologia Molecular de Cepas Isoladas entre 1986 e 2011

Nogueira, Fernanda de Bruycker January 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-03-01T13:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_nogueira_ioc_mest_2013.pdf: 11902421 bytes, checksum: a1e7a08b66fce8b693a1ccced0215385 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Este estudo apresenta a fiogenia e caracterização molecular baseados na análise do gene do envelope (E) (1.485 nucleotídeos) dos DENV-1 (n=48) e na região codificante completa (10.176 nucleotídeos) de seis representantes dentre as 48 amostras analisadas, isolados durante as epidemias ocorridas desde a introdução do sorotipo em 1986 até 2011. Possíveis eventos de recombinação genômica também foram analisados. Os resultados baseados na análise do gene E demonstraram que os DENV-1 isolados dos estados do Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Alagoas, Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte pertencem ao genótipo V (América/África), mas agrupam-se em clades distintos. Três grupos foram identificados, um datando entre 1986-2002 (linhagem 1a), um segundo grupo representado por vírus isolados entre 2009 e 2011 e uma cepa isolada representativa do ano de 2002 (linhagem 2) e um grupo de cepas isoladas em 2010 e 2011 (linhagem 1b). A linhagem 2 apresentou um alto suporte de bootstrap garantindo a sua separação das outras linhagens. As linhagens 1a e 1b, apesar de se agruparem em ramos distintos, foram caracterizadas no mesmo grupo, com bootstrap acima de 75%. Além disso, as linhagens 1a e 1b foram mais relacionadas com as cepas americanas e a linhagem 2 com as cepas asiáticas. As substituições de aminoácidos (aa) foram observadas nos ectodomínios I e III da proteína E e foram associadas à separação das linhagens Uma substituição em E297 diferenciou a linhagem 1a das linhagens 1b e 2. As alterações observadas em E338, E394 (ectodomínio III), E428 e E430 (região \201Cstem\201D) diferenciaram as linhagens 1a, 1b e 2. A análise da região codificante completa apresentou um elevado número de substituições de aa (n=82), distribuídas entre as seis cepas estudadas, no entanto a cepa representante da linhagem 2 apresentou aproximadamente 50% do total observado. Com exceção do gene C, todos os outros genes analisados (prM/M, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) permitiram a classificação genotípica dos DENV-1. Os genes NS3 e NS5 permitiram a separação das linhagens 1 e 2, no entanto, apenas o gene E e a região codificante completa foram capazes de distinguir as linhagens em 1a, 1b e 2. Nenhum evento recombinante foi detectado dentre as amostras do estudo quando comparadas com amostras de referência disponíveis do Genbank, porém uma cepa da linhagem 1a, isolada no estado do Rio de Janeiro em 1988 foi considerada mais relacionada com uma cepa possivelmente recombinante isolada no estado do Paraná no ano de 2001 (amostra de referência AF513110/BR/2001) / This study presents the phylogeny and molecular characterization based on envelope gene (E) analysis of DENV-1 (n=48) isolated during epidemics occurred since this serotype introduction in 1986 to 2011. From those strains, six were fully sequenced (coding region) and possible genomic recombination events were analyzed. The results of the phylogenetic analysis based on the E gene showed that DENV-1 isolates from the states of Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Alagoas, Ceará, Piauí and Rio Grande do Norte belong to genotype V (America/Africa), but grouping in distinct clades. Three groups were identified, one dating from 1986 to 2002 (lineage 1a), a second group isolated between 2009 and 2011 and a representative strain isolated in 2002 (lineage 2) and a group of strains isolated in 2010 and 2011 (lineage 1b). Lineage 2 has a high bootstrap support ensuring their separation from the other lineages. The lineages 1a and 1b, despite in distinct branches, were characterized in a same group supported by a bootstrap of 75%. Furthermore, the lineages 1a and 1b were more closely related to the American strains, while lineage 2 to the Asian strains. Amino acids (aa) substitutions were observed in the ectodomains I and III of the E protein and were associated to the lineages separation. A substitution on E297 differentiated the lineage 1a from the lineages 1b and 2. Changes observed in E338, E394 (ectodomain III), E428 and E430 (stem region) differentiated lineages 1a, 1b and 2. The complete coding region analysis showed a large number of specific aa changes (n=82) distributed among the six strains studied, however lineage 2 presented approximately 50% of the total detected. With the exception of the C gene, all the others genes analyzed allowed the DENV-1 classification into the distinct genotypes. However, only the E gene and the entire coding region were able to group those into the distinct lineages. No recombinant event was detected but a sample belonging to lineage 1a was closely related to the known recombinant strain AF513110/BR/2001
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Identificação de epítopos de célula B na glicoproteína-E do envelope do vírus dengue sorotipo 3 / Identification of B-cell epitopes in the envelope glycoprotein of dengue virus type 3

Silva, Andréa Nazaré Monteiro Rangel da January 2007 (has links)
Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000032.pdf: 4330648 bytes, checksum: bd80b9612f7455644b3a3466bb6b9b7e (MD5) Previous issue date: 2007 / As infecções pelo vírus dengue têm se tornado um problema crescente de Saúde Pública em regiões tropicais e subtropicais do mundo. O vírus pertence à família Flaviviridae com quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a DENV-4). Uma possível estratégia para evitar a patogenia associada com uma vacina para o dengue (que deve ser tetravalente), seria a construção de uma vacina quimérica composta de epítopos críticos selecionados dos quatro sorotipos. A maioria dos epítopos envolvidos na neutralização do vírus está presente na glicoproteína E do envelope, que é a maior proteína de superfície da partícula viral. O objetivo deste trabalho foi identificar epítopos de célula B na glicoproteína E do vírus dengue sorotipo 3. Para o mapeamento de epítopos imunodominantes, noventa e cinco peptídeos (15-mers cada, sobreposição de 10) foram sintetizados (Synpep, California-USA), a partir da sequência de 490 aminoácidos da glicoproteína E do envelope do DENV-3, de cepa circulante no Brasil. Estes peptídeos foram testados por ELISA contra um pool de soros de pacientes positivos e negativos para dengue, coletados durante a fase de convalescença da infecção por DENV-3. Os resultados mostraram que os soros de humanos reagiram com onze, dos noventa e cinco peptídeos testados, distribuídos em 5 regiões com aminoácidos na posições 51-65 (peptídeo 11), 71-90 (peptídeos 15 e 16), 131-170 (peptídeos 27, 28, 29, 30, 31 e 32), 196-210 (peptídeo 40) e 246-260 (peptídeo 50). A análise da curva ROC mostrou que, dentre os peptídeos identificados, nove seriam capazes de diferenciar entre pacientes com DENV-3 de pacientes não-dengue e três capazes de diferenciar a infecção por DENV-3 daquelas por outros sorotipos virais (DENV-1 e DENV-2). Os epítopos imunodominantes aqui descritos, junto com outros epítopos bem documentados, são potencialmente relevantes para o desenho de uma vacina para o vírus dengue e para o desenvolvimento de kits de diagnóstico específicos

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