Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Some animals have a natural resistance to toxic effects induced by
snake venom due to presence of natural endogenous inhibitors in their plasma.
Snake venom contains inhibitors of phospholipase A2 (PLA2) that inhibit the
enzymatic and pharmacological activities of PLA2. In this work we show the
isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 inhibitor from
Crotalus durissus colillineatus (Cdc) snake serum by two chromatographic steps.
Initially, the Cdc serum was applied to a column of ion exchange Q-Sepharose
Fast Flow, producing six peaks of absorbance at A280nm (Q1 to Q6).
Subsequently, Q4 fraction (best results to inhibition) was applied to affinity
chromatography with immobilized HiTrap NHS-BnSP-7. This fractionation resulted
in two fractions (NHS-1 and NHS-2) the second fraction contained the inhibitor,
named γCdcPLI. The molecular mass of γCdcPLI determined by MALDI-TOF
was 22.3kDa and the primary partial structure obtained by Edman and peptide
mass fingerprinting (PMF) MS (MALDI-TOF \\ TOF), showed similarity when
compared with the sequences of other related inhibitors. The secondary structure
was evaluated for circular dichroism and showed approximately 22% alpha helix
and 29% beta sheets.These studies of interaction have also indicated no
significant changes in secondary structure to γCdcPLI and BnSP-7. The results
obtained by analysis of dynamic light scattering (DLS) showed that the inhibitor
has in oligomerization variation, according to temperature and when dissolved in
H2O or PBS. γCdcPLI was able to inhibit the enzymatic, with 100% to inhibition.
Cytotoxicity was assayed on Murine endothelial cell line derived from thymus
hemangioma- tEnd to MTT and myotoxicity was measuring by creatine kinase
(CK) showed inhibition too, but in this case the inhibition was independent dose.
Structural and functional studies of this inhibitor may contribute to understanding
the mechanisms of action of PLA2 inhibitors. In addition, these studies may serve
as starting point for investigating the potential of these inhibitors for the treatment
of snake bite or inflammatory diseases. / Alguns animais apresentam uma resistência natural aos efeitos tóxicos
induzidos por peçonha de serpentes, isto se deve a presença de inibidores
naturais endógenos em seu plasma. Dentre estes, destacam-se os inibidores de
fosfolipases A2 (PLA2), os quais são capazes de inibir as atividades enzimáticas e
farmacológicas de várias PLA2s de peçonhas ofídicas. No presente trabalho, foi
demonstrado o isolamento, a caracterização bioquímica e estrutural de um
inibidor de PLA2, o qual foi isolado do soro da serpente Crotalus durissus
collilineatus (Cdc) por dois passos cromatográficos. Inicialmente o soro de Cdc foi
aplicado em uma coluna de troca-iônica Q-Sepharos, produzindo seis picos de
absorbância a A280nm denominados (Q1 a Q6). Posteriormente, a fração Q4, que
demonstrou melhores resultados de inibição foi submetida a uma cromatografia
de afinidade NHS Hitrap imobilizada com uma PLA2-símile (BnSP-7). Deste
fracionamento resultaram duas frações denominadas de NHS-1 e NHS-2, sendo
que a fração NHS-2 representa o inibidor de PLA2 denominado γCdcPLI. A
massa molecular do inibidor determinada por (MALDI-TOF) foi de 22.34 kDa e a
sequência primária parcial determinada por Edman e Peptide Mass Fingerprinting
(PMF) em MS (MALDI-TOF\\TOF) mostrando similaridade com outros inibidores
do tipo γ. As análises da estrutura secundária realizada por dicroísmo circular
revelaram aproximadamente 22% de alfa hélices e 29% de folhas beta. Estes
estudos também indicaram que não houve alteração significativa na conformação
tanto do γCdcPLI ou da PLA2-símile BnSP-7. Os resultados obtidos por análises
de espalhamento de luz dinâmico demonstraram que o inibidor possui
comportamento de oligomerização mediante variação de temperatura e quando
dissolvido em H2O ou PBS. O γCdcPLI foi capaz de inibir as atividades enzimática
com resultado de 100% na razão 1:5 (m/m) frente as PLA2 utilizadas, miotóxica
por dosagem de CK e citotóxica por MTT em células tEnd com característica de
ser dose não dependente. Estudos estruturais e funcionais deste inibidor poderão
contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos inibidores de PLA2s,
bem como na investigação de seu uso como auxiliar no tratamento do
envenenamento ofídico ou doenças inflamatórias. / Mestre em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15866 |
| Date | 29 July 2013 |
| Creators | Gimenes, Sarah Natalie Cirilo |
| Contributors | Lopes, Daiana Silva, Ávila, Veridiana de Melo Rodrigues, Soares, Andreimar Martins, Fontes, Marcos Roberto de Mattos |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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