Tesis para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer corresponde a la segunda causa de muerte en Chile y el mundo, pero
los pacientes con cáncer no mueren debido al crecimiento del tumor primario,
sino a la diseminación de las células tumorales y posterior colonización de éstas
en nuevos órganos o metástasis. En términos generales, el cáncer es la
consecuencia de un proceso multifactorial que lleva a la transformación
progresiva de células normales en células altamente malignas. La amplia
variedad de fenotipos del cáncer se debe a la manifestación de alteraciones
esenciales en la fisiología celular, las que colectivamente dictaminan el
crecimiento maligno. Dos de las características adquiridas por las células
tumorales en las que se enfocará esta tesis son; la invasión de tejidos y
metástasis y la reprogramación del metabolismo energético.
Caveolina-1 es una proteína integral de membrana a la que se le ha atribuido
un rol dual en la progresión tumoral, actuando como supresor de tumores, ya
que la disminución de la expresión de caveolina-1 es suficiente para revertir el
fenotipo transformado, o como promotor de metástasis en estadios tardíos del
cáncer, donde la expresión de caveolina-1 aumenta sin revertir el fenotipo
maligno y se correlaciona con un aumento en la migración celular y metástasis,
multiresistencia a drogas y una mala prognosis para el paciente. Ambos roles
de caveolina-1 se ven afectados por la presencia de la glicoproteína Ecadherina,
la cual potencia su acción supresora de tumores y suprime la
habilidad de caveolina-1 para promover metástasis in vivo. Sin embargo, el
mecanismo por el cual E-cadherina suprime la habilidad de caveolina-1 para
promover la metástasis no ha sido estudiado.
La habilidad de caveolina-1 para promover un aumento en la migración en
células metastásicas se relaciona con un aumento en la activación de Rab-5 y
Rac-1.
Ya que la reprogramación del metabolismo energético de las células, suple
tanto las necesidades bioenergéticas como biosintéticas de las células
cancerígenas para sostener una proliferación aumentada y una rápida
migración e invasión celular, en este proyecto se caracterizó el fenotipo
metabólico de las células metastásicas que expresan o no, caveolina-1 y
estudiamos cómo la expresión de E-cadherina afecta el metabolismo.
Caveolina-1 sufre modificaciones post-traduccionales que participan en su
función intracelular, como la fosforilación en el residuo de tirosina 14 (Y14),
mediada por las proteínas tirosina quinasas no receptoras Src, Fyn y Abl en
respuesta a varios estímulos como. En células metastásicas de cáncer de
mama, se observan altos niveles de expresión de caveolina-1 y un alto grado de
fosforilación de ésta en Y14, lo que promueve un aumento en la migración
celular por un aumento en el recambio de la adhesiones focales, polarización,
velocidad persistencia y direccionalidad de la migración. Todas estas funciones
de caveolina-1 son bloqueadas por la inhibición de la fosforilación de caveolina-
1 en Y14 tanto de manera farmacológica como por la utilización de una
caveolina-1 que no es fosforilable (Y14F). Por lo tanto, el rol promotor de
metástasis de caveolina-1, dependería de su fosforilación en Y14. La fosfatasa
PTPN14 co-inmunoprecipita con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y
PTPN14 en células de melanoma murino e induce una disminución en la
migración, formación de colonias y crecimiento independiente de anclaje de
células de cáncer de colon.
Estos antecedentes nos llevaron a proponer la siguiente hipótesis: En
presencia de E-cadherina se recluta a la fosfatasa PTPN14 al complejo
multiproteíco formado con caveolina-1 lo que reduce la habilidad
promotora de migración y metástasis de caveolina-1 por la disminución de
la fosforilación de ésta en tirosina 14. El objetivo principal de esta tesis es
determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la
fosforilación en tirosina de caveolina-1 (Y14) y β-catenina (Y654) y la migración e invasión celular en células cancerígenas. Para abordar la hipótesis de trabajo
se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar el efecto de la
co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre los niveles de fosforilación en
tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina y la migración e
invasión celular; (2) Estudiar la participación de Src en la fosforilación en
tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina en presencia y
ausencia de E-cadherina; (3) Determinar si los complejos proteicos formados
con caveolina-1 en presencia de E-cadherina contienen PTPN14, la que
contribuye a la desfosforilación de caveolina-1 en tirosina 14; (4) Determinar el
efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la activación de
Rab-5 y Rac-1; (5) Caracterización de los cambios metabólicos inducidos por la
expresión caveolina-1 y la variación de éstos por la co-expresión con Ecadherina.
Para el desarrollo de los objetivos mencionados se utilizaron líneas
celulares metastásicas en las que se co-expresan caveolina-1 y E-cadherina.
Se realizó ensayos de Western de blot, luego de ensayos de multiherida para
determinar los niveles de fosforilación de caveolina-1 en Y14 y β-catenina en
Y654, ensayos de migración por transwell, ensayos de invasión, ensayos de
precipitación por afinidad para determinar la actividad de Rab-5 y Rac1 en
células que expresan caveolina-1 en presencia o en ausencia de E-cadherina.
Además, se caracterizaron los complejos multiproteícos formados por
caveolina-1, mediante ensayos de inmunoprecipitación y espectrometría de
masa en células que expresan o no E-cadherina y se caracterizó el fenotipo
metabólico de células que expresan o no caveolina-1, estudiando cómo cambia
éste en presencia de E-cadherina.
En resumen en esta tesis se buscó dilucidar el mecanismo mediante el cual Ecadherina
reduce la habilidad promotora de migración, invasión y metástasis de
caveolina-1 en células de cáncer metastásicas.
En este trabajo mostramos que la expresión de E-cadherina inhibe el aumento
en la migración, invasión y metástasis inducido por caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de caveolina-1 en Y14, además, de bloquear la
activación del eje Rab-5/Rac1. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipitó con
caveolina-1 en presencia de E-cadherina y su expresión fue capaz de inhibir el
rol promotor de migración, invasión y metástasis de caveolina-1. Finalmente
mostramos que la expresión y fosforilación de caveolina-1 induce un switch
metabólico a un fenotipo glicolítico aeróbico por el bloqueo del complejo
mitocondrial IV, generando cambios en el metaboloma de las células
metastásicas congruentes con este switch metabólico. La expresión de Ecadherina
bloquea el cambio metabólico inducido por caveolina-1 llevando a las
células a un metabolismo quiescente / Cancer is the second leading cause of death in Chile and in the world. Cancer
patients do not die due to the primary tumor growth, but rather due to the spread
of the cancer cells from the primary tumor and subsequent colonization of new
organs, a process known as metastasis. In general terms, cancer is the result of
a multifactorial process that leads to the progressive transformation of normal
cells into highly malignant cells. The wide variety of cancer phenotypes is due to
alterations in cell physiology that collectively lead to the malignant cell behavior.
Two of the characteristics acquired by tumor cells, on which this thesis will
focus, are tissue invasion, as well as metastasis and reprogramming of energy
metabolism.
Caveolin-1 is a membrane protein that has been attributed a dual role in cancer
progression, acting at early stages as a tumor suppressor given that augmenting
the expression of caveolin-1 is sufficient to reverse the transformed phenotype,
or as a promoter of metastasis in late stages of cancer, where enhanced
expression of caveolin-1 favors the malignant phenotype and correlates with an
increase in cell migration and metastasis, multidrug resistance and poor
prognosis of the patients. Both roles of caveolin-1 are affected by the presence
of the glycoprotein E-cadherin, which enhances caveolin-1 function as a tumor
suppressor and suppresses the ability of caveolin-1 to promote metastasis in
vivo. However, the precise mechanism by which E-cadherin suppresses the
malignant traits of caveolin-1 is unknown.
The ability of caveolin-1 to promote migration of metastatic cells is associated
with increased activation of Rab-5 and Rac-1.
Bearing in mind that the reprogramming of energy metabolism in cancer cells, is
required to supplement both the both the bioenergetic and biosynthetic needs of
these cells to sustain increased proliferation, rapid migration and cell invasion, this thesis also evaluated the metabolism of metastatic cells expressing or not
caveolin-1 and how this was affected by the expression of E-cadherin.
Caveolin-1 is subjected to posttranslational modifications relevant to protein
function, such as phosphorylation on tyrosine 14 (Y14), by the non-receptors
protein tyrosine kinases non-receptor Src, Fyn and Abl. This may occur in
response to a large variety of different stimulus. In metastatic breast cancer
cells, high levels of caveolin-1 expression and phosphorylation on Y14 are
observed and associated with increased cell migration by promoting focal
adhesion turnover, polarization, persistence, speed and directionality of
migration. All these functions of caveolin-1 are blocked by inhibition of caveolin-
1 phosphorylation on Y14 either pharmacologically or by introducing a nonphosphorylatable
caveolin-1 (Y14F) mutation. Therefore, the metastasis
promoting role of caveolin-1 depends on Y14 phosphorylation. The PTPN14
phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of Ecadherin
and PTPN14 in murine melanoma cells and decreased migration,
colony formation and anchorage-independent growth of colon cancer cells.
These results available in the literature led us to propose that in the presence
of E-cadherin PTPN14 is recruited to the multiprotein complex including
caveolin-1 to reduce Y14 phosphorylation, cell migration and metastasis
induced by caveolin-1. The main objective of this thesis was to determine the
effect of co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on tyrosine phosphorylation
of caveolin-1 (Y14) and β-catenin (Y654), as well as migration and invasion in
cancer cells. To address the working hypothesis the following specific objectives
were evaluated: (1) To determine the effect of the co-expression of caveolin-1
and E-cadherin on the levels of tyrosine phosphorylation 14 of caveolin-1 and on
tyrosine 654 of β catenin and migration and cell invasion; (2) To study
participation of Src in the phosphorylation of the tyrosine 14 of caveolin-1 and on
tyrosine β-catenin 654 in the presence and absence of E-cadherin; (3) To
determine whether the protein complexes formed with caveolin-1 in the presence of E-cadherin contain PTPN14, and if this phosphatase contributes to
dephosphorylation of tyrosine 14 of caveolin-1; (4) To determine the effect of coexpression
of caveolin-1 and E-cadherin on the activation of Rab-5 and Rac-1;
(5) To characterization of the metabolic changes induced by caveolin-1
expression and the effect of the co-expression with E-cadherin on cell
metabolism. To address these objectives metastatic cell lines that co-expressed
caveolin-1 and E-cadherin were used. Multiple wounding assays and Western
blot analysis was used to determine the phosphorylation levels of caveolin-1 on
Y14 and β-catenin on Y654 moreover migration assays, invasion assays, affinity
precipitation assays were employed to determine the activity of Rab-5 and Rac1
in cells expressing caveolin-1 in the presence or absence of E-cadherin.
Furthermore, protein composition the analysis of the multiprotein complex
formed by caveolin-1 and E-cadherin was evaluated following
immunoprecipitation assays by mass spectrometry analysis. The metabolic
phenotype of cells expressing or not caveolin-1 was characterized using
Seahorse extracellular analyzer and metabolic changes in presence of Ecadherin
were determined.
In summary, this thesis sought to elucidate the mechanism by which E-cadherin
reduces the ability of caveolin-1 to promote migration, invasion and metastasis
as well as metabolic reprograming of metastatic cancer cells.
In this study, we show that the expression of E-cadherin prevented caveolin-1-
enhanced migration, invasion and metastasis by reducing caveolin-1
phosphorylation on Y14 and, as a consequence, blocking of the activation of the
Rab-5/Rac-1 signaling axis. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated
with caveolin-1 in the presence of E-cadherin and overexpression or this
phosphatase was sufficient to prevent the migration, invasion and metastasis
promoting role of caveolin-1, even in the absence of E-cadherin.
Finally we show that the expression caveolin-1 induced a metabolic switch to an
aerobic glycolytic phenotype, likely by blocking the mitochondrial complex IV.
These effects coincided in metastatic melanoma cells with changes in the
metabolome. Moreover, the expression of E-cadherin blocked the metabolic
changes induced by caveolin-1 leading to a quiescent metabolic phenotype in
metastatic cells / Conicyt-FONDAP; Fondecyt ; Anillo ACT / 31 de diciembre de 2018
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/140680 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Díaz Valdivia, Natalia |
| Contributors | Quest, Andrew F. G., Leyton Campos, Lisette |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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