A xilanase e a α-amilase são enzimas responsáveis por degradar parte da matéria orgânica nos solos, atuando na mineralização da hemicelulose e do amido, respectivamente. Do ponto de vista biotecnológico, estas enzimas, assim como os subprodutos gerados pela sua ação enzimática, podem ser utilizados em diversos setores industriais. Os manguezais podem representar uma fonte promissora e inexplorada para a busca de enzimas microbianas em função das altas quantidades de matéria vegetal em decomposição presente neste ecossistema, onde ocorrem condições ambientais únicas, representadas pela combinação da anaerobiose e salinidade. No presente trabalho, métodos independentes e dependentes de cultivo microbiano foram utilizados para a bioprospecção de enzimas xilanolíticas e amilolíticas em um ambiente de manguezal. A partir da triagem funcional de uma biblioteca metagenômica foram obtidos 3 clones xilanolíticos. Estes foram sequenciados e os reads utilizados para montagem dos contigs e posterior anotação dos genes. Uma das ORFs geradas da anotação do contig MgrBr135 foi utilizada para subclonagem em vetor de expressão demonstrando atividade amilolítica. A análise filogenética do contig MgrBr135 mostrou afiliação da mesma ao filo Planctomycetes. Por meio do método dependente de cultivo, foram isolados 44 bactérias xilanolíticas do solo de manguezal. Destas, 73% apresentaram índices enzimáticos (IE) elevados quando submetidos ao teste qualitativo (cup plate). A estirpe bacteriana 11 foi a que se destacou das demais por ter apresentado IE de 10,9. Quando submetidas ao teste quantitativo, o isolado 39 se destacou produzindo uma atividade enzimática de 0,43 U/mL. O sequenciamento parcial do gene 16S rRNA das estirpes permitiu a identificação dos isolados como pertencentes a dois gêneros: Bacillus e Paenibacillus. Estes resultados destacam a importância de estudos sobre as bactérias encontradas nos manguezais, e indicam os grupos bacterianos que hospedam estas características, o que deve dar maior suporte a exploração deste recurso como ferramentas biotecnológicas, a serem utilizadas na degradação da hemicelulose e amido. / Xylanase and α-amylase are enzymes that degrade organic matter, acting in the mineralization of hemicellulose and starch, respectively. These enzymes, as well as the byproducts generated by them, can be used in various industrial sectors. Mangroves represent a promising and untapped source of microbial enzymes due to the high content of decomposing organic matter present in this ecosystem, where unique environmental conditions prevail, represented by the combination of anaerobiose and salinity. In this study, independent and dependent microbial cultivation methods were used for bioprospecting xylanolytic and amylolytic enzymes in a mangrove environment. Through the functional screening of a metagenomic library, 3 xylanolytic clones were obtained. These clones were sequenced, and the reads were used for contig assembly followed by gene annotation. One of the ORFs generated by the annotation of contig MgrBr135 was used for subcloning into the expression vector, showing later amylase activity. Phylogenetic analysis of contigs MgrBr135 indicated its affiliation to the phylum Planctomycetes. Through the cultivation dependent method, 44 xylanolytic bacteria were isolated from mangrove soil. From these, 73% had considerable enzymatic index (EI) when subjected to the qualitative test (cup plate). The bacterial strain 11 was the one that stood out from the others because it presented the highest EI, 10.9. When subjected to quantitative test, the isolated 39 stood out producing an enzyme activity of 0.43 U/mL. The partial 16S rRNA gene sequencing of the strains allowed the characterization of two genera: Bacillus and Paenibacillus. These results highlight the importance of studying the bacterial community found in mangroves, and indicate the bacterial groups hosting these features, supporting further exploitation of this resource as biotechnological tools that can be used in the degradation of hemicellulose and starch.

A xilanase e a α-amilase são enzimas responsáveis por degradar parte da matéria orgânica nos solos, atuando na mineralização da hemicelulose e do amido, respectivamente. Do ponto de vista biotecnológico, estas enzimas, assim como os subprodutos gerados pela sua ação enzimática, podem ser utilizados em diversos setores industriais. Os manguezais podem representar uma fonte promissora e inexplorada para a busca de enzimas microbianas em função das altas quantidades de matéria vegetal em decomposição presente neste ecossistema, onde ocorrem condições ambientais únicas, representadas pela combinação da anaerobiose e salinidade. No presente trabalho, métodos independentes e dependentes de cultivo microbiano foram utilizados para a bioprospecção de enzimas xilanolíticas e amilolíticas em um ambiente de manguezal. A partir da triagem funcional de uma biblioteca metagenômica foram obtidos 3 clones xilanolíticos. Estes foram sequenciados e os reads utilizados para montagem dos contigs e posterior anotação dos genes. Uma das ORFs geradas da anotação do contig MgrBr135 foi utilizada para subclonagem em vetor de expressão demonstrando atividade amilolítica. A análise filogenética do contig MgrBr135 mostrou afiliação da mesma ao filo Planctomycetes. Por meio do método dependente de cultivo, foram isolados 44 bactérias xilanolíticas do solo de manguezal. Destas, 73% apresentaram índices enzimáticos (IE) elevados quando submetidos ao teste qualitativo (cup plate). A estirpe bacteriana 11 foi a que se destacou das demais por ter apresentado IE de 10,9. Quando submetidas ao teste quantitativo, o isolado 39 se destacou produzindo uma atividade enzimática de 0,43 U/mL. O sequenciamento parcial do gene 16S rRNA das estirpes permitiu a identificação dos isolados como pertencentes a dois gêneros: Bacillus e Paenibacillus. Estes resultados destacam a importância de estudos sobre as bactérias encontradas nos manguezais, e indicam os grupos bacterianos que hospedam estas características, o que deve dar maior suporte a exploração deste recurso como ferramentas biotecnológicas, a serem utilizadas na degradação da hemicelulose e amido. / Xylanase and α-amylase are enzymes that degrade organic matter, acting in the mineralization of hemicellulose and starch, respectively. These enzymes, as well as the byproducts generated by them, can be used in various industrial sectors. Mangroves represent a promising and untapped source of microbial enzymes due to the high content of decomposing organic matter present in this ecosystem, where unique environmental conditions prevail, represented by the combination of anaerobiose and salinity. In this study, independent and dependent microbial cultivation methods were used for bioprospecting xylanolytic and amylolytic enzymes in a mangrove environment. Through the functional screening of a metagenomic library, 3 xylanolytic clones were obtained. These clones were sequenced, and the reads were used for contig assembly followed by gene annotation. One of the ORFs generated by the annotation of contig MgrBr135 was used for subcloning into the expression vector, showing later amylase activity. Phylogenetic analysis of contigs MgrBr135 indicated its affiliation to the phylum Planctomycetes. Through the cultivation dependent method, 44 xylanolytic bacteria were isolated from mangrove soil. From these, 73% had considerable enzymatic index (EI) when subjected to the qualitative test (cup plate). The bacterial strain 11 was the one that stood out from the others because it presented the highest EI, 10.9. When subjected to quantitative test, the isolated 39 stood out producing an enzyme activity of 0.43 U/mL. The partial 16S rRNA gene sequencing of the strains allowed the characterization of two genera: Bacillus and Paenibacillus. These results highlight the importance of studying the bacterial community found in mangroves, and indicate the bacterial groups hosting these features, supporting further exploitation of this resource as biotechnological tools that can be used in the degradation of hemicellulose and starch.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissetaccao_ jaina convertido encadernadora.pdf: 2928797 bytes, checksum: 85949e85bf169f2b4b0fd1a4a31a60bf (MD5) Previous issue date: 2015-12-08 / The! xylanolytic! complex! is! formed! by! a! group! of! enzymes! capable! of! acting! on! multiple!binding!sites!in!the!chain!of!xylan,!hemicellulose!one!found!in!plant!cell!walls! and! to! degrade! it! into! Xylooligosaccharides,! xilotrioses,! xilobioses! and! xylose.! The! endoI1,4IβIxylanases! (1,4IβIDIxylan!xylanohydrolasen!EC!3.2.1.8),!which!hydrolyze! the! xylan! backbone! randomly,! producing! a! mixture! of! xylooligosaccharidesn! βI xylosidases!(EC!3.2.1.37)!which!hydrolyze!only!xylan!short!chains,!releasing!xylosen! Acetyl! xylan! esterases! (EC! 3.1.1.72)! which! hydrolyse! acetate! groups! of! the! main! chain!and!αILIarabinofuranosidases!(EC!3.2.1.55)!which!hydrolyse!arabinofuranose! side!chains.!In!recent!decades,!interest!in!microbial!xylanase!has!increased!because! of! its! potential! for! biotechnological! applications:! they! have! been! used! in! various! industrial!sectors,!including:!the!supplementation!of!feed!monogastric!animalsn!in!the! preIbleaching!of!pulp!and!paper!pulpn!the!saccharification!of!lignocellulosic!biomass,! in!the!textile!industry,!in!baking!and!clarification!of!juices!and!wines.!In!this!context,! this!study!aimed!to!purify!and!characterize!biochemically!the!xylanaseII!of!the!fungus! Penicillium#crustosum!using!corn!stover!as!inducer!source!in!liquid!culture,!and!their! biotechnological!applications.!The! xylanaseII! of!P.# crustosum!was!purified! from! the! crude!extract!obtained! from! stationary! liquid!culture!supplemented!with!corn! stover! 2%.! After! three! chromatographic! columns! (DEAE,! CMISephadex! and! filtration! column! Sephadex! GI75)! the! enzyme! exhibited! homogeneity! and! presented! a! molecular!mass!of!23.44!kDa!single!band.!The!xylanaseII!exhibited!optimum!pH!5.0! and! stability! in! the! pH! range! from! 4.0! to! 7.0.! The! optimum! temperature! of! the! xylanase!was!50!°C,!with!a!half!life!of!62!minutes!at!50!°C,!but!at!40!°C!and!45!°C! the!enzyme!showed!halfIlife!(T½)!of!120!minutes!and!74!minutes,!respectively.!The! kinetic! parameters! for! the! Beechwood! xylan! substrate! Km! was! 1.56! mg/mL! and! Vmax!1,000!mol/!min!/!mL.!EDTA!compounds!and!Mn2+!increased!xylanase!activity! by!47%!and!75%,!respectively,!while!Na+!and!Ca2+!inhibited!the!enzyme!activity!18%! and! 22%! at! a! concentration! of! 5! mM.! The! crude! extract! and! purified! xylanaseII! showed! no! cytotoxic! effect,! thus! they! can! be! applied! in! the! food! industry.! The! xylanaseII!was!effective! in! clarifying! the!guava! juice,!pear!and!mango,! resulting! in! turbidity! of! 91,! 87! e! 89%,! respectively.! Therefore,! the! xylanaseII! P.! crustosum! showed! relevant! properties! for! application! in! food! industry,! especially! for! clarifying! juices!process.! / O!complexo! xilanolítico!é! formado!por!um!grupo!de!enzimas!capazes!de!atuar!em! vários! sítios! da! cadeia! do! xilano,! uma! hemicelulose! encontrada! na! parede! celular! das!plantas,!e!degradáIlo!em!xilooligossacarídeos,! xilotrioses,! xilobioses!e! xiloses.!! As!endoI1,4IβIxilanases!(1,4IβIDIxilano!xilanohidrolasen!EC!3.2.1.8)!que!hidrolisam! a! cadeia! principal! do! xilano! de! modo! aleatório,! produzindo! uma! mistura! de! xilooligossacarídeosn! βIxilosidases! (E.C.! 3.2.1.37),! que! hidrolisam! apenas! cadeias! curtas! de! xilano,! liberando! xilosen! acetil! xilano! esterases! 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Penicillium# crustosum! utilizando! palha! de! milho! como! fonte! indutora! em! cultivo! líquido,! bem! como! sua! aplicação! biotecnológica.!A!xilanaseII!do!fungo!P.#crustosum!foi!purificada!a!partir!do!extrato! bruto! obtido! de! cultivo! líquido! estacionário! suplementado! com! palha! de! milho! 2%.! Após! três! colunas! cromatográficas! (DEAE,! CMISephadex! e! coluna! de! filtração! Sephadex! GI75)! a! enzima! exibiu! homogeneidade! e! apresentou! massa! molecular! com! uma! única! banda! de! 23,44! kDa.! A! xilanaseII! exibiu! pH! ótimo! de! 5,0! e! estabilidade!na!faixa!de!pH!entre!4,0I7,0.!A!temperatura!ótima!da!xilanase!foi!50!°C,! com!meia!vida!de!62!minutos!a!50!°C,!porém!a!40!°C!e!45!ºC!a!enzima!exibiu!meia! vida!(T½)!de!120!minutos!e!74!minutos,!respectivamente.!!Os!parâmetros!cinéticos! para! o! substrato! xilano! de! Beechwood! foram! Km! de! 1,56! mg/mL! e! Vmáx! 1.000! μmol/min/mL.!Os! compostos!EDTA! e!Mn2+! aumentaram! a! atividade! xilanásica! em! 47%!e!75%,!respectivamente,!enquanto!que!o!Na+!e!Ca2+!inibiram!a!ação!enzimática! em!18%!e!22%!na!concentração!de!5!mM.!O!extrato!bruto!e!a!xilanaseII!purificada! não!apresentou!efeito! citotóxico,!consequentemente!estes!podem!ser!aplicados!na! indústria!alimentícia.!A!xilanaseII!foi!eficaz!na!clarificação!dos!sucos!de!goiaba,!pêra! e!manga! resultando!em!turbidez!de! 91,! 87! e!89%! respectivamente!em!relação!ao! controle.!Assim,!a! xilanaseII! de!P.# crustosum!exibiu!propriedades! interessantes!de! aplicaçã

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissetaccao_ jaina convertido encadernadora.pdf: 2928797 bytes, checksum: 85949e85bf169f2b4b0fd1a4a31a60bf (MD5) Previous issue date: 2015-12-08 / SIM(não especificado) / The! xylanolytic! complex! is! formed! by! a! group! of! enzymes! capable! of! acting! on! multiple!binding!sites!in!the!chain!of!xylan,!hemicellulose!one!found!in!plant!cell!walls! and! to! degrade! it! into! Xylooligosaccharides,! xilotrioses,! xilobioses! and! xylose.! The! endoI1,4IβIxylanases! (1,4IβIDIxylan!xylanohydrolasen!EC!3.2.1.8),!which!hydrolyze! the! xylan! backbone! randomly,! producing! a! mixture! of! xylooligosaccharidesn! βI xylosidases!(EC!3.2.1.37)!which!hydrolyze!only!xylan!short!chains,!releasing!xylosen! Acetyl! xylan! esterases! (EC! 3.1.1.72)! which! hydrolyse! acetate! groups! of! the! main! chain!and!αILIarabinofuranosidases!(EC!3.2.1.55)!which!hydrolyse!arabinofuranose! side!chains.!In!recent!decades,!interest!in!microbial!xylanase!has!increased!because! of! its! potential! for! biotechnological! applications:! they! have! been! used! in! various! industrial!sectors,!including:!the!supplementation!of!feed!monogastric!animalsn!in!the! preIbleaching!of!pulp!and!paper!pulpn!the!saccharification!of!lignocellulosic!biomass,! in!the!textile!industry,!in!baking!and!clarification!of!juices!and!wines.!In!this!context,! this!study!aimed!to!purify!and!characterize!biochemically!the!xylanaseII!of!the!fungus! Penicillium#crustosum!using!corn!stover!as!inducer!source!in!liquid!culture,!and!their! biotechnological!applications.!The! xylanaseII! of!P.# crustosum!was!purified! from! the! crude!extract!obtained! from! stationary! liquid!culture!supplemented!with!corn! stover! 2%.! After! three! chromatographic! columns! (DEAE,! CMISephadex! and! filtration! column! Sephadex! GI75)! the! enzyme! exhibited! homogeneity! and! presented! a! molecular!mass!of!23.44!kDa!single!band.!The!xylanaseII!exhibited!optimum!pH!5.0! and! stability! in! the! pH! range! from! 4.0! to! 7.0.! The! optimum! temperature! of! the! xylanase!was!50!°C,!with!a!half!life!of!62!minutes!at!50!°C,!but!at!40!°C!and!45!°C! the!enzyme!showed!halfIlife!(T½)!of!120!minutes!and!74!minutes,!respectively.!The! kinetic! parameters! for! the! Beechwood! xylan! substrate! Km! was! 1.56! mg/mL! and! Vmax!1,000!mol/!min!/!mL.!EDTA!compounds!and!Mn2+!increased!xylanase!activity! by!47%!and!75%,!respectively,!while!Na+!and!Ca2+!inhibited!the!enzyme!activity!18%! and! 22%! at! a! concentration! of! 5! mM.! The! crude! extract! and! purified! xylanaseII! showed! no! cytotoxic! effect,! thus! they! can! be! applied! in! the! food! industry.! The! xylanaseII!was!effective! in! clarifying! the!guava! juice,!pear!and!mango,! resulting! in! turbidity! of! 91,! 87! e! 89%,! respectively.! Therefore,! the! xylanaseII! P.! crustosum! showed! relevant! properties! for! application! in! food! industry,! especially! for! clarifying! juices!process.! / O!complexo! xilanolítico!é! formado!por!um!grupo!de!enzimas!capazes!de!atuar!em! vários! sítios! da! cadeia! do! xilano,! uma! hemicelulose! encontrada! na! parede! celular! das!plantas,!e!degradáIlo!em!xilooligossacarídeos,! xilotrioses,! xilobioses!e! xiloses.!! As!endoI1,4IβIxilanases!(1,4IβIDIxilano!xilanohidrolasen!EC!3.2.1.8)!que!hidrolisam! a! cadeia! principal! do! xilano! de! modo! aleatório,! produzindo! uma! mistura! de! xilooligossacarídeosn! βIxilosidases! (E.C.! 3.2.1.37),! que! hidrolisam! apenas! cadeias! curtas! de! xilano,! liberando! xilosen! acetil! xilano! esterases! (E.C.! 3.1.1.72)! que! hidrolisam! grupos! acetato! da! cadeia! principal! e! a! αILIarabinofuranosidases! (E.C.! 3.2.1.55),!que!hidrolisam!arabinofuranose!das!cadeias!laterais.!Nas!últimas!décadas,! o! interesse! por! xilanases! microbianas! tem! aumentado! devido! o! seu! potencial! de! aplicação! biotecnológica,! elas! têm! sido! utilizadas! em! vários! setores! industriais,! incluindo:! na! suplementação! da! ração! de! animais! monogástricos,! no! préI branqueamento! da! polpa! de! papel! e! celulose,! na! sacarificação! de! biomassa! lignocelulósica,!na!indústria!têxtil,!na!panificação!e!na!clarificação!de!sucos!e!vinhos.! Neste! contexto,! este! estudo! teve! como! objetivo! purificar! e! caracterizar! bioquimicamente! a! xilanaseII# do! fungo! Penicillium# crustosum! utilizando! palha! de! milho! como! fonte! indutora! em! cultivo! líquido,! bem! como! sua! aplicação! biotecnológica.!A!xilanaseII!do!fungo!P.#crustosum!foi!purificada!a!partir!do!extrato! bruto! obtido! de! cultivo! líquido! estacionário! suplementado! com! palha! de! milho! 2%.! Após! três! colunas! cromatográficas! (DEAE,! CMISephadex! e! coluna! de! filtração! Sephadex! GI75)! a! enzima! exibiu! homogeneidade! e! apresentou! massa! molecular! com! uma! única! banda! de! 23,44! kDa.! A! xilanaseII! exibiu! pH! ótimo! de! 5,0! e! estabilidade!na!faixa!de!pH!entre!4,0I7,0.!A!temperatura!ótima!da!xilanase!foi!50!°C,! com!meia!vida!de!62!minutos!a!50!°C,!porém!a!40!°C!e!45!ºC!a!enzima!exibiu!meia! vida!(T½)!de!120!minutos!e!74!minutos,!respectivamente.!!Os!parâmetros!cinéticos! para! o! substrato! xilano! de! Beechwood! foram! Km! de! 1,56! mg/mL! e! 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Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4498.pdf: 2023528 bytes, checksum: b6d98480ef338423f24d2704afae90bd (MD5) Previous issue date: 2012-06-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The use of alternative and renewable fuels is vital to solve the problems derived from the dependence of fuels, and the vegetal biomass is the only renewable source available in large scale that can be converted in energy. The bioethanol production has demonstrated a huge potential to minimize the environmental changes resultant from fossil fuels consumption. Nevertheless, the production costs of cellulolytic complexes lays out one of the major obstacle of the economical viability of the second generation ethanol. Therefore, the bioprospection and the understanding of enzymes involved in the process can improve the complexes productivity. Xylanases are enzymes used in several biotechnological processes, primordially for biopulping and biobleaching in papel industries. However, current surveys have investigated these enzymes due to an accessory role for bioethanol production. In this study, an endoxylanase (xyn3) gene from Trichoderma harzianum was cloned into Pichia pastoris. The constitutive vector pGAPZαA was used, changing the α-factor by the native signal peptide of the enzyme, and with a 6xHisTag at C-terminus. The recombinant protein were expressed in two majority forms, one with a molecular mass of 35 kDa (non-glycosylated) and the other with 60 kDa (glycosylated). Both forms showed xylanolytic activity in zymogram and were biochemically analyzed. The enzymes present optimal temperature of 40°C and pH 6.5, and stable activity until 30°C. The glycosylation plays important role in the enzymatic kinects of the recombinant enzyme, showing a catalytic efficiency twice higher of glycosylated form, in comparison with the activity of the non-glycosylated form. Even in this study, the effects of cellulose and xylan on the regulation of expression of the xyn2, xyn3 and egl3 genes were investigated to T. harzianum. All studied genes were overexpressed under all induction conditions and the results indicate a higher and earlier expression of these genes in fungus induction using a mixture of cellulose and xylan. Furthermore, an advance in the period of induction was observed while the fungus was cultivated with steam explosed bagasse supplemented with endoxylanase 3, when compared with the pure bagasse utilization. These findings enhance the vii understanding of enzymatic mode of action involved in deconstruction of plant cellular wall, whick can be used in the second generation ethanol production. / A utilização de combustíveis alternativos e renováveis é vital para resolver os problemas derivados da dependência de combustíveis fosseis, e a biomassa vegetal é a única fonte renovável disponível em larga escala que pode ser convertida em energia. A produção de bioetanol tem demonstrado um enorme potencial para minimizar as alterações ambientais resultantes do consumo de combustíveis fósseis. No entanto, os custos de produção de complexos celulolíticos constituem um dos maiores obstáculos da viabilidade econômica do etanol de segunda geração. Portanto, a bioprospecção e a compreensão das enzimas envolvidas no processo podem melhorar a produtividade dos complexos. Xilanases são enzimas usadas em vários processos biotecnológicos, primordialmente para biopolpação e biobranqueamento nas indústrias de papel e celulose. No entanto, as pesquisas atuais têm buscado por estas enzimas devido a um papel acessório na produção de bioetanol. Neste estudo, uma endoxilanase (xyn3) de Trichoderma harzianum foi clonada em Pichia pastoris. O vetor de expressão constitutivo pGAPZαA foi usado, alterando-se o factor-α pelo peptídeo sinal nativo da enzima, e com uma sequência 6xHisTag no C-terminal. A proteína recombinante foi expressa em duas formas majoritárias, uma com uma massa molecular de 35 kDa (não-glicosilada) e a outra com 60 kDa (glicosilada). Ambas as formas mostraram atividade xilanolítica em zimograma e foram analisadas bioquimicamente. As enzimas mostraram temperatura ótima de 40°C e pH 6,5, e com atividade estável até aproximadamente 30°C. A glicosilação apresentou um papel importante na cinética enzimática da enzima recombinante, que mostrou uma eficiência catalítica duas vezes mais elevada em sua forma glicosilada, em comparação com a atividade da forma não-glicosilada. Ainda neste estudo, foram investigados os efeitos de celulose e xilana na regulação da expressão dos genes xyn2, xyn3 e egl3 no T. harzianum. Todos os genes estudados foram superexpressos sob todas as condições de indução e os resultados indicaram uma expressão mais elevada e precoce destes genes utilizando-se uma mistura de celulose e xilana. Além disso, um avanço no período de indução foi observado quando o fungo foi cultivado com bagaço explodido suplementado com endoxilanase 3, quando comparado com a utilização do bagaço v puro. Estes resultados contribuem para o entendimento do mecanismo de ação do sistema enzimático envolvido na desconstrução da parede celular vegetal, o qual pode ser utilizado na produção do etanol de segunda geração.

Submitted by Michel Ricardo Gracioli (michel-rg@hotmail.com) on 2018-04-17T15:51:19Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Michel.pdf: 1706772 bytes, checksum: 1d66fae75b86a68d89ec8bceca0d2f31 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-18T14:13:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gracioli_mr_me_rcla.pdf: 1697470 bytes, checksum: 82696e96fe2dfed0fbd786c7230a8994 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T14:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gracioli_mr_me_rcla.pdf: 1697470 bytes, checksum: 82696e96fe2dfed0fbd786c7230a8994 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As enzimas xilanases são de grande interesse biotecnológico em função da sua habilidade na degradação da molécula de xilana, a principal hemicelulose presente na parede celular de plantas. Tais enzimas encontram aplicações nos mais diversos ramos da indústria como na produção de alimentos e bebidas, de cosméticos, de ração animal, de biocombustíveis entre outros. Em razão da sua composição química, os subprodutos lignocelulósicos, produzidos em grande quantidade pela agroindústria, se apresentam como uma potencial fonte sustentável para a produção de valiosos compostos como biocombustíveis, fertilizantes, rações, produtos químicos e enzimas. Assim, tendo em vista esse contexto, foi desenvolvido o presente trabalho, cujo objetivo foi caracterizar e purificar a principal endoxilanase produzida por uma linhagem de Aspergillus hortai cultivado em estado sólido e aplicá-la, nas formas bruta e purificada, na hidrólise de subprodutos agroindustriais. A purificação da enzima foi alcançada após três etapas cromatográficas, respectivamente, uma cromatografia de troca iônica seguida por cromatografias de interação hidrofóbica e exclusão molecular. Ao final das etapas, a enzima purificada apresentou recuperação de 1,1% e fator de purificação de 15,8 vezes. A enzima bruta e purificada se mostrou tolerante ao NaCl na presença de até 4 M do sal. Por outro lado, foi pouco tolerante à presença de íons e alguns compostos como Hg2+, Cu2+, SDS, Triton X-100 e TWEEN 20/80. Em contrapartida, DTT e β-mercaptoetanol a 10 mM estimularam a atividade da enzima bruta em 13 e 19%, respectivamente. Para a enzima bruta, a temperatura e pH ótimos de reação foram, respectivamente, 60 °C e 6,0 tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 e 2,5 M. Apresentou boa estabilidade térmica a 40 °C na ausência de NaCl, e foi ativada na presença de 0,5 M e 2,5 M do sal durante as 4 h de incubação. A enzima bruta e purificada foi estável em uma ampla faixa de pHs (3,0-8,0) na ausência e na presença de NaCl e apresentou alta especificidade pelas xilanas birchwood, beechwood e oat spelt, não tendo sido detectadas atividades endoglucanase sobre CMC, exoglucanase em Avicel e β-xilosidase em ρNPX. Após a purificação, os perfis de temperatura e pH ótimos de reação se mantiveram em 60 °C e 6, respectivamente. A enzima pura foi, também, bastante estável a temperatura de 40 °C, mantendo mais de 50% da atividade controle durante as 4 h de incubação, e ao pH, variando de 3,0-8,0, na ausência e na presença de NaCl. Xilobiose e xilo-oligossacarídeos superiores foram os produtos formados na hidrólise da xilana oat spelt pela enzima purificada, sugerindo ação enzimática do tipo endoxilanase. A massa molecular aparente, após a purificação, foi estimada em 25,0 kDa por SDS-PAGE e em 14,8 kDa por exclusão molecular. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx em xilana de beechwood sofreram variações em resposta a presença de NaCl, sendo a maior eficiência catalítica obtida na presença de 2,5 M do sal (kcat/km 40,91). A análise da composição química dos subprodutos - sabugo, palha e folha de milho - revelou, respectivamente, 25,6%, 45,3% e 34,9% de carboidratos, 19,7%, 15,2% e 17,6% de lignina e 9,0%, 17,4% e 24,0% de extrativos para a biomassa in natura e, 33,3%, 25,2% e 38,8% de carboidratos e 6,5%, 8,9% e 12,3% de lignina para a xilana extraída desses subprodutos. A extração das hemiceluloses utilizando tratamento alcalino oxidativo resultou em um rendimento de 64% para o sabugo, 18% para a palha e 50% para a folha. A enzima bruta e purificada foi capaz de hidrolisar as biomassas na forma in natura, bem como as xilanas extraídas desse material produzindo majoritariamente xilopentoses e xilohexoses. Sendo assim, pode-se afirmar que a xilanase bruta e purificada em estudo apresentou propriedades interessantes para a aplicação industrial, especialmente na produção de xilo-oligossacarídeos e em processos conduzidos sob elevada salinidade. / Xylanases raise a biotechnological interest due to its ability to degrade xylan. Such enzymes find use in a variety of industrial processes such as the production of food and beverage, cosmetics, animal feed, second generation ethanol, among many others. As for its chemical composition, lignocellulosic byproducts, widely produced by agroindustry, presents itself as a potential sustainable source for production of valuable composts like soil fertilizers, animal feed, chemical products and enzymes. In this context, the main xylanase produced by an Aspergillus hortae strain, cultivated in solid state (SSF), was characterized, purified and applied in the hydrolysis of hemicellulose from corn by-products. Enzyme purification was achieved after three chromatographyc steps, respectively, an ion exchange chromatography followed by hydrophobic interaction and molecular exclusion chromatographys. After the purification steps, a final yield of 1.1% and purification fold of 15.8 was achieved. Both crude and purified enzyme showed high tolerance to NaCl in the presence of up to 4 M of the salt. The enzyme displayed a very low tolerance to some metal ions and chemical compounds, especially Hg2+, Cu2+, SDS, Triton X-100 and TWEEN 20/80. On the other hand, DTT and β- mercaptoetanol at 10 mM stimulated crude enzyme activity in 13% and 19%, respectively. As for the crude enzyme, optimum temperature and pH were, respectively, 60 °C and 6.0, in the absence and presence of 0.5 and 2.5 M NaCl. It showed good thermal stability at 40 °C in the absence of NaCl and was activated in the presence of 0.5 and 2.5 M of the salt throughout the 4 h incubation time. Crude and purified enzyme was also stable over a wide pH range (3.0 - 8.0) both in the absence and presence of NaCl and presented high specificity for birchwood, beechwood and oat spelt xylans, not showing detectable endoglucanase, exoglucanase and β- xylosidase activities. After purification, optimum temperature and pH profiles remained at 60 °C and 6.0, respectively. Purified enzyme showed good stability at 40 °C, being able to retain more than 50% of the control activity during 4 h of incubation, and to the pH, varying from 3.0 to 8.0, in the absence and in the presence of NaCl. Xylobiose and xilooligosaccharides were the products of oat spelt xylan hydrolysis by the purified enzyme, suggesting an endoxilanase mode of action. The apparent molecular mass, after purification, was estimated to be 25.0 kDa by SDS-PAGE and 14.8 kDa by exclusion chromatography. Kinetic parameters of Km and Vmáx using beechwood xylan were 5.12 mg/mL and 14.25 μmol/min.mL, respectively, in the absence of NaCl, 9.56 mg/mL and 20.80 μmol/min.mL in the presence of 0.5 M and 3.13 mg/mL and 9.22 μmol/min.mL in the presence of 2.5 M of the same salt. Chemical analysis of the biomasses from corn cob, stover and leaves, revealed a composition of, respectively, 25.6%, 45.3%, 34.9% carbohydrates, 19.7%, 15.2%, 17.6% lignin and 9.0%, 17.4%, 24.0% extractives for in natura biomasses and 33.3%, 25.2%, 38.8% carbohydrates and 6.5%, 8.9%, 12.3% lignin for the extracted hemicelluloses. Hemicellulose extraction yields were of 64% for corn cob, 18% for stover and 50% for leaves. Both crude and purified enzyme was capable of hydrolyzing in natura biomasses, as well as the extracted hemicelluloses from these materials, producing mainly xylopentoses and xyloheoses. In summary, the xylanase presented attractive properties for industrial applications, especially in the production of xyloolygossacharides and in those carried out under high NaCl concentration. / CNPq: 130841/2016-1.

Palm oil empty fruit bunches (EFB) is an abundant and cheap lignocellulose material in South East Asia. Its use as the sole medium for producing lignocellulose-hydrolyzing enzymes would increase its commercial value. A newly isolated Aspergillus niger DSM 26641 was investigated for its capability of producing hemicellulases in EFB hydrolysate obtained by treatment with pressurized hot water (1-20%, w/v) at 120-180◦C in a 1 L Parr reactor for 10-60 min. The optimal hydrolysate for the fungal growth and endoxylanase production was obtained when 10% (w/v) of empty fruit bunch was treated at 120◦C or 150◦C for 10 min, giving an endoxylanase activity of 24.5 mU ml-1 on RBB-Xylan and a saccharification activity of 5 U ml-1 on xylan (DNS assay). When the hydrolysates were produced at higher temperatures, longer treatment times or higher biomass contents, only less than 20% of the above maximal endoxylanase activity was detected, possibly due to the higher carbohydrate concentrations in the medium. Transcriptome analysis showed that 3 endoxylanases (expression levels 59-100%, the highest level was set as 100%), 2 b-xylosidases (4%), 4 side chain-cleaving arabinofuranosidases (1-95%), 1 acetyl xylan esterase (9%) and 2 ferulic acid esterases (0.3-9%) were produced together.

For complete degradation of hemicellulose into its monomers from lignocellulose biomass, the synergistic action of a broad range of hydrolytic enzymes is needed. Therefore, production of enzymes from their natural producer is desirable. To obtain a powerful b-1,4-endoxylanase producing fungus, 304 environmental samples were collected from various locations in Singapore, leading to 603 isolates. Among them, 71 exhibiting b-1,4-endoxylanase activity were identified belonging mainly to the genera of Aspergillus, Penicillium, and Trichoderma. Further analysis revealed Aspergillus niger DSM 26641 as a potential and stable b-1,4-endoxylanase producer, being able to grow in hydrothermal lignocellulose hydrolysate exhibiting its maximal b-1,4-endoxylanase activity at pH 4 and 60◦C. This strain is thought to be very suitable for lactic acid production in a simultaneous saccharification and fermentation at pH values below 5.