Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s. / Myonecrosis is an important medical complication resulting from snakebites and, in severe cases, local myonecrosis can lead to drastic consequences such as permanent tissue loss, disability or limb amputation. Venomous and non-venomous snakes possess proteins that inhibit phospholipases A2 (PLA2s) in their bloodstream, called PLIs. One hypothesis that could explain the presence of these PLIs in the serum of venomous snakes would be the self-protection against their own venom enzymes, which could eventually reach the circulatory system. In the present work, an inhibitory protein (called ?BaltMIP) that neutralizes the enzymatic and toxic activities of several bothropic PLA2s was isolated from Bothrops alternatus plasma by affinity chromatography using the myotoxin BthTX-I immobilized on a CNBr-activated Sepharose resin. This protein showed relative molecular mass of 24,000 under reducing conditions on SDS-PAGE and greater specificity of inhibition of the cytotoxic and myotoxic activities of Lys49 PLA2-like enzymes compared to the anticoagulant and phospholipase activities of Asp49 PLA2s. In addition, molecular modeling was performed by in silico analysis of both tertiary and quaternary structures of ?BaltMIP. Furthermore, a model of interaction between alpha inhibitors of myotoxins and these toxins was proposed, bringing a new approach to the study of these enzymes. Cloning and expression of the inhibitor (called rBaltMIP in its recombinant form) were also achieved successfully, followed by its partial biochemical characterization. Nterminal sequencing and reverse phase HPLC showed that rBaltMIP was purified in a high purity degree, with 100% sequence identity with the native inhibitor. The inhibitory properties of rBaltMIP were tested against PLA2s and PLA2-like enzymes. rBaltMIP was able to partially inhibit the phospholipase activity of different enzymes, also inhibiting the cytotoxic and myotoxic activity of different Lys49 PLA2-like enzymes. Heterologous expression of rBaltMIP should help obtaining such inhibitor in large-scale, and consequently, the performance of further studies on the mechanism of inhibition of PLA2s, which has not yet been fully clarified. In addition, new information regarding the mechanism of action of these inhibitors may be known, in an attempt to better understand the application of these proteins as new therapeutic models with antiophidian action in neutralizing different types of PLA2s, the supplementation of conventional serum therapy and also in the molecular interaction with PLA2s.

Foi realizado o pirossequenciamento de duas bibliotecas de cDNA do intestino médio de Tenebrio molitor e as sequências foram submetidos à montagem através do programa Newbler. Visando sanar alguns questionamentos a respeito de muitos tipos de transportadores que pudessem estar envolvidos com funções presumíveis em tamponamento luminal, absorção de nutrientes, envolvimento em mecanismos de secreção de enzimas como a α-manosidases e secreção e absorção de água, foram analisadas sequências de interesse que pudessem esclarecer os fenômenos fisiológicos em questão. O pirossequenciamento revelou 19 sequencias de α-manosidases. Após alinhamentos múltiplos, desconfiou-se que o contig 12 era a continuação da sequência original da α-manosidase. Utilizando-se de iniciadores apropriados, a suspeita foi confirmada e uma sequência completa foi obtida e denominada de TmMan1. Através de cladogramas gerados com as sequências de todos os contigs obtidos, assim como de sequências representativas das famílias 38 e 47 das glicosídeos hidrolases, mostrou que todas a nossas sequências, exceto o contig 6 e 7, pertencem à família 38. Todas as sequências com mais de 100 reads (exceto o contig 9) tiveram a sua expressão tecidual avaliada por RT-PCR. Os resultados mostraram que só são expressos no intestino ou intestino e túbulo de Malpighi, implicando na possibilidade de serem digestivas. Dessas sequências, as únicas com peptídeo sinal são a TmMan1 (contig 12) e o contig 14 e, portanto, devem corresponder às atividades Man1 e Man2. Levando em conta o número de reads, TmMan1 deveria corresponder a Man2 e o contig 14 à Man1. É possível, embora necessite de confirmação, que os contigs 8 e 15 sejam de expressão lisossômica. Um peptídeo sintetizado que correspondia a sequencia única da TmMan1 foi usado para gerar anticorpos, que reconheceram a Man2, mas não a Man1, confirmando a identificação de TmMan1 com a Man2. Esse anticorpo foi também utilizado para imunolocalizar a TmMan1 nas células intestinais de T. molitor. Os resultados mostraram que a TmMan1 é secretada de forma apócrina pela região anterior de intestino de T. molitor. Esse trabalho é o primeiro que mostra a ocorrência de α-manosidases com especificidade similar àquelas lissossômicas, mas que são secretadas apócrinamente para fora da célula, devendo agir no lúmen intestinal, removendo resíduos de manoses de oligossacarídeos manosilados. Foram identificados 10 tipos diferentes de transportadores e na elaboração dos modelos fisiológicos só foram levados em conta aqueles expressos exclusivamente no intestino médio ou no intestino médio e túbulos de Malpighi. A V-ATPase em T.molitor parece ser uma bomba usada para energizar muitos dos transportes ao longo do intestino médio como, por exemplo, o de oligopeptídeos. Já as bombas de Na+ e K+ são responsáveis pelo equilíbrio de cargas e, portanto estão presentes na maioria dos tipos celulares. Duas sequências de cotransportadores de oligopeptídeos/H+ foram encontradas no pirossequenciamento e sua expressão é maior na região posterior, uma vez que ali é a última possibilidade de absorção dos oligopeptídeos que ainda estiverem no lúmen, remanescentes da digestão final de proteínas. Foi demonstrado que T.Molitor absorve aminoácidos e açúcares ao longo de todo o intestino médio, pois estes tipos de transportadores possuem uma expressão uniforme ao longo do intestino médio. Já a expressão dos transportadores de NH3/NH4+ em T.molitor, encontra-se confinada ás regiões onde o pH do intestino médio do inseto é mais ácida. Também há uma expressão de transportadores de cloreto que se manifesta mais intensamente na região anterior. Podemos visualizar que a distribuição dos contigs dos transportadores de bicarbonato encontra-se mais expressiva na região posterior do intestino médio. Os resultados sugerem que a acidificação na região anterior do intestino de T.molitor pode resultar da secreção de NH4+ acompanhado do íon cloreto e a alcalinização na região posterior do lançamento no lúmen de bicarbonato. A importância dos canais de cloreto é que o mesmo balanceia as cargas e desta forma pode ser útil juntamente com o transporte de NH4+, que gera uma carga no lado onde é transportado. Há absorvição de água (junto com glicose) ao longo de todo o intestino médio, enquanto que a secreção de água ocorreria apenas nos dois terços finais do intestino médio com o auxílio de aquaporinas complementado por transportadores de íons, teria como consequência a abosorção líquida de água na região anterior e uma secreção líquida no final do intestino médio. Isso esclarece qual a base molecular para a ocorrência do contrafluxo intestinal evidenciado por experimentos fisiológicos. / Pyrosequencing was performed with two cDNA libraries in the midgut of Tenebrio molitor and the sequences were subjected to assembly with the Newbler program. In order to tackle questions concerning proteins which may be involved in midgut buffering, nutrient absorption, in the secretion of enzymes such as α-mannosidases , and water absorption and secretion, sequences of interest were analyzed in order to clarify those physiological phenomena. The pyrosequencing revealed 19 sequences of α- mannosidases . After multiple alignments, it was suspected that the contig 12 was the continuation of the original sequence of the α-mannosidase. Using appropriate primers, the hypothesis was confirmed and a complete sequence was obtained and named TmMan . Through cladograms generated from the sequences of the contigs obtained, as well as of sequences representing families 38 and 47 of glycoside hydrolases, it was showed that all sequences except the contig 6 and 7 belong to family 38. All sequences with over 100 reads (except contig 9) had their tissue expression assessed by RT-PCR. The results showed that they are expressed only in the midgut or midgut and Malpighian tubules, implying the possibility of having a digestive function. Among these sequences, the only ones with a signal peptide are TmMan1 (contig 12) and contig 14 and therefore they should correspond to the activities Man1 and Man2. Taking into account the number of reads, TmMan1 should correspond to Man2 and contig 14 to Man1. It is possible, though it requires confirmation, that the contigs 8 and 15 are lysosomal. A peptide corresponding to the unique sequence TmMan1 was synthesized and used to generate antibodies that recognized Man2 , but not Man1, confirming the identification of TmMan1 with Man2. This antibody was also used to immunolocalyze TmMan1 in the midgut cells of T. molitor. The results showed that TmMan1 is secreted in an apocrine way by the anterior region of T. molitor midgut. This is the first study that shows the occurrence of α-mannosidases with similar specificity to those lysosomal, but that are secreted in an apocrine way, acting in the midgut lumen, removing mannoses from mannosylated oligosaccharides. We identified 10 different types of carriers and in the development of physiological models it was only taken into account those expressed exclusively in the midgut or midgut and Malpighian tubules . The V- ATPase in T.molitor appears to be a pump used for powering many transports along the midgut, as of oligopeptides. The Na+ and K+ pumps are responsible for charge load balancing and therefore are present in most cell types. Two sequences of oligopeptide / H+ cotransporters were found in the transcriptome and their expression is higher in the posterior region. This agrees with the fact that there is the last possibility of oligopeptides remaining in the lumen to be absorbed. It is highly probable that T.molitor absorbs amino acids and sugars throughout the midgut, once these types of carriers have a uniform expression throughout the midgut . The expression of NH3/NH4+ transporters in T.molitor is confined to the regions where the pH of the insect midgut is more acidic. There is also chloride transporter expression there. The expression of bicarbonate transporters is more significant in the posterior midgut. The results suggest that acidification in the anterior T.molitor midgut may result from the secretion of NH4+ and chloride ions together, whereas the alkalization in the posterior midgut results from bicarbonate release. There is water absortion (along with glucose) throughout the midgut , while the water secretion occurs only in the final two-thirds of the midgut with the aid of aquaporins, complemented by ion transporters. It would result in the net absorption and net secretion of water in the anterior and postertior midgut, respectively. This clarifies the molecular basis of the midgut countercurrent fluxes evidenced by physiological experiments.

Identifying the ‘Lucanians’ has long been a complex issue. Myriad approaches have sought to correlate the archaeological record with ancient Greek and Roman narrative, while others have attempted to analyse aspects of warfare, burial rituals, grave goods and architectural typologies from a ‘Lucanian’ perspective. However, one fundamental aspect of cultural identity has hitherto been neglected: food-ways and the domestic food system in particular. Within the discussion of household knowledge, Aristotle notes ‘men must all have food, and the differences in their food have made differences in their way of life’. Despite the incompatibility of hierarchical organisation and the city-state model for ancient ‘Lucania’, the household remains the smallest unit upon which socio-political organisation of any type is rooted; the analysis of food preparation and cooking, beginning at the household level, is therefore essential for the study of ancient identity. Utilising the domestic food system methodology – spatial analysis on food preparation and cooking spaces, artefact analysis related to food-ways and both zooarchaeological and palaeobotanical evidence – this thesis reinvestigates 4th-2nd century BC habitation structures, drawing previously unseen patterns to the fore: 1) a female domestic area inclusive of food preparation, cooking and textile production; 2) an architectural distinction between domestic and ritual food preparation and cooking areas; and 3) communal dining that rejects elite banqueting rituals. That the artefact is an integral dimension of culture is axiomatic. Yet, scholarly approaches to ‘Lucanian’ cultural identity have failed to investigate the behaviour patterns and social interactions imbued within the objects that form the domestic food system. The intrinsic connection to identity encompassed in cookware ceramics, zooarchaeological evidence and domestic assemblages – and, in the relationships to both each other and to the interior space – creates a cultural boundary that provides invaluable information for the study of ‘Lucanian’ identity and, further, facilitates comparative research with similar groups of peoples. The domestic food system procures the baseline upon which shifts in socio-economic and political organisation can be overlaid, thus furthering the overall objective of this thesis: to recognise emerging patterns of cultural resilience and identity related to food practices.

Foi realizado o pirossequenciamento de duas bibliotecas de cDNA do intestino médio de Tenebrio molitor e as sequências foram submetidos à montagem através do programa Newbler. Visando sanar alguns questionamentos a respeito de muitos tipos de transportadores que pudessem estar envolvidos com funções presumíveis em tamponamento luminal, absorção de nutrientes, envolvimento em mecanismos de secreção de enzimas como a α-manosidases e secreção e absorção de água, foram analisadas sequências de interesse que pudessem esclarecer os fenômenos fisiológicos em questão. O pirossequenciamento revelou 19 sequencias de α-manosidases. Após alinhamentos múltiplos, desconfiou-se que o contig 12 era a continuação da sequência original da α-manosidase. Utilizando-se de iniciadores apropriados, a suspeita foi confirmada e uma sequência completa foi obtida e denominada de TmMan1. Através de cladogramas gerados com as sequências de todos os contigs obtidos, assim como de sequências representativas das famílias 38 e 47 das glicosídeos hidrolases, mostrou que todas a nossas sequências, exceto o contig 6 e 7, pertencem à família 38. Todas as sequências com mais de 100 reads (exceto o contig 9) tiveram a sua expressão tecidual avaliada por RT-PCR. Os resultados mostraram que só são expressos no intestino ou intestino e túbulo de Malpighi, implicando na possibilidade de serem digestivas. Dessas sequências, as únicas com peptídeo sinal são a TmMan1 (contig 12) e o contig 14 e, portanto, devem corresponder às atividades Man1 e Man2. Levando em conta o número de reads, TmMan1 deveria corresponder a Man2 e o contig 14 à Man1. É possível, embora necessite de confirmação, que os contigs 8 e 15 sejam de expressão lisossômica. Um peptídeo sintetizado que correspondia a sequencia única da TmMan1 foi usado para gerar anticorpos, que reconheceram a Man2, mas não a Man1, confirmando a identificação de TmMan1 com a Man2. Esse anticorpo foi também utilizado para imunolocalizar a TmMan1 nas células intestinais de T. molitor. Os resultados mostraram que a TmMan1 é secretada de forma apócrina pela região anterior de intestino de T. molitor. Esse trabalho é o primeiro que mostra a ocorrência de α-manosidases com especificidade similar àquelas lissossômicas, mas que são secretadas apócrinamente para fora da célula, devendo agir no lúmen intestinal, removendo resíduos de manoses de oligossacarídeos manosilados. Foram identificados 10 tipos diferentes de transportadores e na elaboração dos modelos fisiológicos só foram levados em conta aqueles expressos exclusivamente no intestino médio ou no intestino médio e túbulos de Malpighi. A V-ATPase em T.molitor parece ser uma bomba usada para energizar muitos dos transportes ao longo do intestino médio como, por exemplo, o de oligopeptídeos. Já as bombas de Na+ e K+ são responsáveis pelo equilíbrio de cargas e, portanto estão presentes na maioria dos tipos celulares. Duas sequências de cotransportadores de oligopeptídeos/H+ foram encontradas no pirossequenciamento e sua expressão é maior na região posterior, uma vez que ali é a última possibilidade de absorção dos oligopeptídeos que ainda estiverem no lúmen, remanescentes da digestão final de proteínas. Foi demonstrado que T.Molitor absorve aminoácidos e açúcares ao longo de todo o intestino médio, pois estes tipos de transportadores possuem uma expressão uniforme ao longo do intestino médio. Já a expressão dos transportadores de NH3/NH4+ em T.molitor, encontra-se confinada ás regiões onde o pH do intestino médio do inseto é mais ácida. Também há uma expressão de transportadores de cloreto que se manifesta mais intensamente na região anterior. Podemos visualizar que a distribuição dos contigs dos transportadores de bicarbonato encontra-se mais expressiva na região posterior do intestino médio. Os resultados sugerem que a acidificação na região anterior do intestino de T.molitor pode resultar da secreção de NH4+ acompanhado do íon cloreto e a alcalinização na região posterior do lançamento no lúmen de bicarbonato. A importância dos canais de cloreto é que o mesmo balanceia as cargas e desta forma pode ser útil juntamente com o transporte de NH4+, que gera uma carga no lado onde é transportado. Há absorvição de água (junto com glicose) ao longo de todo o intestino médio, enquanto que a secreção de água ocorreria apenas nos dois terços finais do intestino médio com o auxílio de aquaporinas complementado por transportadores de íons, teria como consequência a abosorção líquida de água na região anterior e uma secreção líquida no final do intestino médio. Isso esclarece qual a base molecular para a ocorrência do contrafluxo intestinal evidenciado por experimentos fisiológicos. / Pyrosequencing was performed with two cDNA libraries in the midgut of Tenebrio molitor and the sequences were subjected to assembly with the Newbler program. In order to tackle questions concerning proteins which may be involved in midgut buffering, nutrient absorption, in the secretion of enzymes such as α-mannosidases , and water absorption and secretion, sequences of interest were analyzed in order to clarify those physiological phenomena. The pyrosequencing revealed 19 sequences of α- mannosidases . After multiple alignments, it was suspected that the contig 12 was the continuation of the original sequence of the α-mannosidase. Using appropriate primers, the hypothesis was confirmed and a complete sequence was obtained and named TmMan . Through cladograms generated from the sequences of the contigs obtained, as well as of sequences representing families 38 and 47 of glycoside hydrolases, it was showed that all sequences except the contig 6 and 7 belong to family 38. All sequences with over 100 reads (except contig 9) had their tissue expression assessed by RT-PCR. The results showed that they are expressed only in the midgut or midgut and Malpighian tubules, implying the possibility of having a digestive function. Among these sequences, the only ones with a signal peptide are TmMan1 (contig 12) and contig 14 and therefore they should correspond to the activities Man1 and Man2. Taking into account the number of reads, TmMan1 should correspond to Man2 and contig 14 to Man1. It is possible, though it requires confirmation, that the contigs 8 and 15 are lysosomal. A peptide corresponding to the unique sequence TmMan1 was synthesized and used to generate antibodies that recognized Man2 , but not Man1, confirming the identification of TmMan1 with Man2. This antibody was also used to immunolocalyze TmMan1 in the midgut cells of T. molitor. The results showed that TmMan1 is secreted in an apocrine way by the anterior region of T. molitor midgut. This is the first study that shows the occurrence of α-mannosidases with similar specificity to those lysosomal, but that are secreted in an apocrine way, acting in the midgut lumen, removing mannoses from mannosylated oligosaccharides. We identified 10 different types of carriers and in the development of physiological models it was only taken into account those expressed exclusively in the midgut or midgut and Malpighian tubules . The V- ATPase in T.molitor appears to be a pump used for powering many transports along the midgut, as of oligopeptides. The Na+ and K+ pumps are responsible for charge load balancing and therefore are present in most cell types. Two sequences of oligopeptide / H+ cotransporters were found in the transcriptome and their expression is higher in the posterior region. This agrees with the fact that there is the last possibility of oligopeptides remaining in the lumen to be absorbed. It is highly probable that T.molitor absorbs amino acids and sugars throughout the midgut, once these types of carriers have a uniform expression throughout the midgut . The expression of NH3/NH4+ transporters in T.molitor is confined to the regions where the pH of the insect midgut is more acidic. There is also chloride transporter expression there. The expression of bicarbonate transporters is more significant in the posterior midgut. The results suggest that acidification in the anterior T.molitor midgut may result from the secretion of NH4+ and chloride ions together, whereas the alkalization in the posterior midgut results from bicarbonate release. There is water absortion (along with glucose) throughout the midgut , while the water secretion occurs only in the final two-thirds of the midgut with the aid of aquaporins, complemented by ion transporters. It would result in the net absorption and net secretion of water in the anterior and postertior midgut, respectively. This clarifies the molecular basis of the midgut countercurrent fluxes evidenced by physiological experiments.

Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s. / Myonecrosis is an important medical complication resulting from snakebites and, in severe cases, local myonecrosis can lead to drastic consequences such as permanent tissue loss, disability or limb amputation. Venomous and non-venomous snakes possess proteins that inhibit phospholipases A2 (PLA2s) in their bloodstream, called PLIs. One hypothesis that could explain the presence of these PLIs in the serum of venomous snakes would be the self-protection against their own venom enzymes, which could eventually reach the circulatory system. In the present work, an inhibitory protein (called ?BaltMIP) that neutralizes the enzymatic and toxic activities of several bothropic PLA2s was isolated from Bothrops alternatus plasma by affinity chromatography using the myotoxin BthTX-I immobilized on a CNBr-activated Sepharose resin. This protein showed relative molecular mass of 24,000 under reducing conditions on SDS-PAGE and greater specificity of inhibition of the cytotoxic and myotoxic activities of Lys49 PLA2-like enzymes compared to the anticoagulant and phospholipase activities of Asp49 PLA2s. In addition, molecular modeling was performed by in silico analysis of both tertiary and quaternary structures of ?BaltMIP. Furthermore, a model of interaction between alpha inhibitors of myotoxins and these toxins was proposed, bringing a new approach to the study of these enzymes. Cloning and expression of the inhibitor (called rBaltMIP in its recombinant form) were also achieved successfully, followed by its partial biochemical characterization. Nterminal sequencing and reverse phase HPLC showed that rBaltMIP was purified in a high purity degree, with 100% sequence identity with the native inhibitor. The inhibitory properties of rBaltMIP were tested against PLA2s and PLA2-like enzymes. rBaltMIP was able to partially inhibit the phospholipase activity of different enzymes, also inhibiting the cytotoxic and myotoxic activity of different Lys49 PLA2-like enzymes. Heterologous expression of rBaltMIP should help obtaining such inhibitor in large-scale, and consequently, the performance of further studies on the mechanism of inhibition of PLA2s, which has not yet been fully clarified. In addition, new information regarding the mechanism of action of these inhibitors may be known, in an attempt to better understand the application of these proteins as new therapeutic models with antiophidian action in neutralizing different types of PLA2s, the supplementation of conventional serum therapy and also in the molecular interaction with PLA2s.

This study argues that the so-called Sicilian Slave Wars are best understood as two differing instances of civic disquiet, social disorder and provincial revolt in Sicily, rather than as slave wars. Both events are reconnected to their Sicilian context geographically, politically and socially, and shown to have arisen from those contexts. This thesis is demonstrated in seven chapters. Chapter I reassesses the principle evidence for the kingdom established by the rebels in the first war: their numismatic issues. This evidence is best understood in the context of contemporary Sicilian numismatics and emphasises the Sicilian nature of the uprising. It is argued that the insurgency was contingent on the support of certain parts of the (free) Sicilian populace. Chapter II presents a reinterpretation of Diodorus’ text from a narratological point of view. The text is shown to be highly rhetorical and constructed with a view to demonise the leaders of the first war, Eunus and Cleon, through reference to Hellenistic stereotypes of femininity, cowardliness, magic and banditry. Chapter III argues that Diodorus’ explanation of the origin of the war is anachronistic and shows evidence of narratorial intervention and invention, thereby rendering his interpretation unreliable. Chapter IV considers Cicero’s Verrine Orations and shows that his engagement with the two wars in the text cannot be used as a reliable indicator of historical fact because of the text’s continual engagement with history. Chapter V argues that the two leaders of the so-called Second Slave War, Salvius/Tryphon and Athenion, were described using the same matrix of ideas that were present for Eunus and Kleon, for the same rhetorical and narratological effect. Chapter VI analyses Diodorus’ narrative of the origin of the war, and shows that Diodorus only provides a chronology of coincidental events, and beyond a single connective narrative line, demonstrates no connection between these events. Finally, Chapter VII suggests that the best context in which to understand this war is that of a general breakdown of social order on Sicily at the end of the second century B.C. caused by internal political problems in the cities of Sicily. Further, the insurgency led by Salvius/Tryphon and Athenion is shown to be only part of a broader crisis on Sicily that stretched from 106-93 B.C., part of an extended stasis for the island. In sum, I argue that the events typically referred to as the Sicilian Slave Wars are better understood through a focus on the historical contexts provided by the Hellenistic milieu in which the wars arose and the development of the Roman provincial system – rather than through the (preconceived) lens of slavery: instead of servile unrest, there was civic disquiet, social disorder and provincial revolt on Sicily in the 2nd century BC.

The study of Florentine artistic patronage has attracted several approaches over the last three decades, including the exploration of patron-­‐client structures and how the use of art in private and public spheres contributed to shape families’s identity. Building on past research, this work focuses on the art patronage of a prominent, yet overlooked, family, the Vespucci, to whom Amerigo, the navigator who reached the coasts of America in the late fifteenth century, belonged. Although the family’s importance was achieved through a synergy of political, religious and intellectual forces, attention is given to the Vespucci’s engagement with the arts and their key contribution to Florence’s humanistic culture between the years 1470-­1500. The family’s houses and private chapels are analysed, and three artists, Botticelli, Ghirlandaio and Piero di Cosimo, considered. Combining history, art history, and archival resources, new evidence and interpretations are advanced to ascribe selected artworks -­ controversially believed to be Vespucci commissions - to the private patronage of this Florentine family. Examining the Vespucci’s artistic taste in private and public settings, whilst attempting a reconstruction of partially lost painted commissions, deepens comprehension on the role that domestic and social life played in the creation of art and culture; the family’s force in shaping spaces; and the practice of buying, commissioning, and displaying as a means of signifying wealth, increasing status, and establishing identity. Power seekers, the Vespucci entered the Medici intellectual circles through which they created chains of friendship with prominent families inside and outside of Florence. As questions about shared artistic tastes and the paradigmatic role of the Medici artistic patronage have been the focus of scholarly enquiry, this study of the Vespucci provides an insight into the family’s spreading of new ideas and its interaction with the development of the visual arts. Investigation into the Vespucci’s breadth of interests helps to reframe the current knowledge of Florentine cultural exchanges and to contextualise the family’s influence beyond the geographical discoveries it has been exclusively associated with.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3317_1.pdf: 2166498 bytes, checksum: d5bfcd3bc431cd02d014bbe1cd32b6f6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / A partir da calcinação da gipsita (CaSO4.2H2O) pode ser obtido o gesso α ou o gesso β, que possuem características distintas, podendo ser aplicados em diversas áreas, tais como na construção civil, na indústria química, na indústria farmacêutica, na odontologia, etc. A utilização de aditivos é uma prática utilizada para se obter produtos melhorados. No presente trabalho, estudou-se a adição de polissacarídeos. Foram feitos ensaios de consistência, calor de hidratação, tempo de pega e resistência à compressão para avaliar o efeito dos polissacarídeos adicionados. A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para visualizar as modificações ocorridas na microestrutura dos cristais formados após a adição de hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, celulose, amido e dextrina. O carboximetilcelulose de sódio e o hidroxipropilmetilcelulose foram os aditivos que apresentaram influências mais significativas na consistência, no tempo de pega e na resistência à compressão. A adição de 0,025% de carboximetilcelulose de sódio provocou o aumento no tempo de pega inicial e final de 4,2 e 6,7 para 4,7 e 10,2 minutos, respectivamente. Na concentração de 0,1%, o tempo de pega inicial e final passou para 83 e 103,5 minutos. A diferença de comportamento apresentada pelos polissacarídeos se deve à maior ou menor adsorção do aditivo à superfície do cristal. A facilidade de adsorção do grupo COO- do carboximetilcelulose de sódio nos íons de cálcio presentes na superfície do cristal de gesso promoveu o efeito retardante no tempo de pega

This dissertation concerns the reception of the myth of Alexander the Great in Italian art during the fifteenth and sixteenth centuries. In particular, I discuss the turning-point in the tradition which took place in Renaissance Italy around the middle of the fifteenth century: the transition from the medieval imagery of Alexander as a legendary, almost fairy-tale, figure to the historical portrait of him as an exemplum of moral virtue and military prowess. On the basis of the corpus known as the Alexander Romance, during the Middle Ages Alexander was depicted as a fabled explorer and knight, whose marvellous adventures enjoyed huge popularity both in the literary tradition and in the visual arts. Around the mid-fifteenth century, with the changing cultural atmosphere associated with the rise of humanism, this medieval conception was superseded by a different image of Alexander, drawing on the newly discovered ancient historical accounts of Plutarch, Curtius Rufus, Arrian and Diodorus Siculus. There are five chapters, all illustrated, plus an introduction and conclusion. Chapter 1 provides an overview of the literary and iconographic tradition of Alexander in Italy from 1100 to 1400, exploring the most popular episodes from the legend. In Chapter 2, I present examples of the persistence of the legendary tradition in the Quattrocento (especially, some fresco cycles of the Nine Worthies). Chapter 3 is concerned with the humanist recovery of ancient sources and its impact on the received view of Alexander; the important contribution of Petrarch and Boccaccio is also examined. Chapter 4 deals with the emergence of a new Renaissance portrait of Alexander around 1450, notably in paintings on marriage chests. In Chapter 5 I discuss the development of this new image of Alexander in the sixteenth century, with the establishment of an iconographic repertoire, centring on novel episodes taken from ancient historical sources.

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