Os queijos artesanais, elaborados com leite cru, são apreciados por suas características sensoriais peculiares. Com objetivo de assegurar a inocuidade destes produtos, a legislação brasileira estabeleceu padrões microbiológicos sanitários para estes alimentos. Microorganismos probióticos são conhecidos por sua capacidade de modular favoravelmente a microbiota do hospedeiro por meio da produção de substâncias antimicrobianas, em especial, os ácidos orgânicos e bacteriocinas. Assim, o presente estudo buscou avaliar a utilização de micro-organismos probióticos como alternativa para melhorar a qualidade microbiológica de queijos artesanais usando o Queijo Artesanal da Serra da Mantiqueira como modelo. Para tanto, foi incorporada à microbiota do leite uma preparação composta de 16 cepas de micro-organismos probióticos, obtendo-se uma concentração final de 3x106 UFC/ml de leite. A estratégia adotada consistiu em comparar os queijos inoculados com micro-organismos probióticos em relação aos queijos não inoculados (controle), durante o período de maturação de 45 dias, em três estações do ano (inverno, verão e outono). As amostras foram coletadas nos dias 1, 15, 30 e 45 para a determinação dos parâmetros: umidade, pH, concentrações de carboidratos, ácidos orgânicos e análises microbiológicas. Avaliou-se também a composição da microbiota dos queijos pela técnica do pirossequenciamento dos genes do rRNA 16S. Os resultados permitiram verificar que os gêneros predominantes na microbiota dos queijos foram Streptococcus, Lactobacillus e Lactococcus , em diferentes níveis nas três estações do ano. Foi possível observar que a incorporação das culturas probióticas resultou em diferentes efeitos nas estações avaliadas no que se refere às concentrações de carboidratos e ácido cítrico, bem como de ácidos orgânicos ao final dos 45 dias de maturação, possivelmente devido à variabilidade da microbiota verificada nas diferentes estações. No tocante às características microbiológicas, observou-se que, durante o período de maturação, 95% dos queijos confeccionados nas diferentes condições apresentaram padrões de qualidade em conformidade com o estabelecido na legislação, no que se refere às concentrações de coliformes termotolerantes, estafilococos coagulase positivos, Salmonella sp e Listeria sp independentemente da incorporação das culturas probióticas. Entretanto, a adição das culturas probióticas reduziu a carga microbiana de gêneros da família Enterobacter iaceae , em especial Enterobacter , Citrobacter , Klebsiella , Kluyvera e Obesumbacterium durante processo de maturação. Especificamente, o emprego das culturas probióticas resultou em redução do percentual total de Enterobacter iaceae na microbiota dos queijos de 0,41% para 0,17% no verão, e de 12,42% para 6,71% no outono. Neste contexto, a adição de culturas probióticas pode constituir alternativa viável para melhoria da qualidade microbiológica de queijos elaborados com leite cru por meio do incremento do potencial antagônico da microbiota sobre espécies de micro-organismos potencialmente patogênicos, toxigênicos e deteriorantes, além de agregar valor ao produto final. / Artisanal cheeses, made with raw milk, are appreciated for their sensorial profiles, which differentiates them from industrialized cheeses. In order to ensure safety to consumers, Brazilian legislation established microbiological standards for these products. Probiotics are well known for their ability to favorably modulate the host\'s microbiota by producing antimicrobial compounds, mainly organic acids and bacteriocins. Therefore, this study aimed to evaluate the use of probiotic microorganisms as an alternative to improve the microbiological quality of artisanal cheeses through inhibition of contaminating microorganisms, using Mantiqueira Highlands Artisanal Cheese as a model. To do so, a preparation consisting of 16 probiotic strains was added to the milk, at a final concentration of 3x106 CFU/ml. Additionally, the effects of this practice on pH, carbohydrates and organic acids concentrations over a 45 day ripening period were evaluated. Analyses of cheese bacterial community composition were also undertaken by means of 16S rRNA gene pyrosequencing. The strategy consisted of comparing cheeses made with probiotic cultures with a control group, to which no probiotic culture was added. Over a 45 day ripening period, in three seasons (winter, summer and autumn), samples were collected at days 1, 15, 30 and 45 in order to conduct pH, moisture, carbohydrate, organic acids, microbiological and pyrosequencing analyses. The results showed that the addition of probiotic cultures resulted in distinct effects in the different seasons regarding carbohydrate and organic acids concentrations, possibly due to variability in bacterial community composition. The results also demonstrated that 95% of cheeses were deemed acceptable according to Brazilian law regarding coliforms, positive coagulase staphylococci, Salmonella sp. and Listeria sp, regardless of adding probiotics. However, the incorporation of probiotic microorganisms resulted in reduced populations of genera belonging to Enterobacteriaceae family, especially Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Kluyvera and Obesumbacterium, throughout the whole ripening process. Specifically, the addition of probiotic cultures reduced the total percentage of Entercobacteriaceae from 0,41% to 0,17% in the summer, and from 12,42% to 6,71% in the fall. In this context, the use of probiotic microorganisms may represent a viable alternative for improving microbiological quality of raw milk cheeses by means of incrementing the antagonistic potential of cheese microbiota towards potentially pathogenic and toxigenic microorganisms.

Os queijos artesanais, elaborados com leite cru, são apreciados por suas características sensoriais peculiares. Com objetivo de assegurar a inocuidade destes produtos, a legislação brasileira estabeleceu padrões microbiológicos sanitários para estes alimentos. Microorganismos probióticos são conhecidos por sua capacidade de modular favoravelmente a microbiota do hospedeiro por meio da produção de substâncias antimicrobianas, em especial, os ácidos orgânicos e bacteriocinas. Assim, o presente estudo buscou avaliar a utilização de micro-organismos probióticos como alternativa para melhorar a qualidade microbiológica de queijos artesanais usando o Queijo Artesanal da Serra da Mantiqueira como modelo. Para tanto, foi incorporada à microbiota do leite uma preparação composta de 16 cepas de micro-organismos probióticos, obtendo-se uma concentração final de 3x106 UFC/ml de leite. A estratégia adotada consistiu em comparar os queijos inoculados com micro-organismos probióticos em relação aos queijos não inoculados (controle), durante o período de maturação de 45 dias, em três estações do ano (inverno, verão e outono). As amostras foram coletadas nos dias 1, 15, 30 e 45 para a determinação dos parâmetros: umidade, pH, concentrações de carboidratos, ácidos orgânicos e análises microbiológicas. Avaliou-se também a composição da microbiota dos queijos pela técnica do pirossequenciamento dos genes do rRNA 16S. Os resultados permitiram verificar que os gêneros predominantes na microbiota dos queijos foram Streptococcus, Lactobacillus e Lactococcus , em diferentes níveis nas três estações do ano. Foi possível observar que a incorporação das culturas probióticas resultou em diferentes efeitos nas estações avaliadas no que se refere às concentrações de carboidratos e ácido cítrico, bem como de ácidos orgânicos ao final dos 45 dias de maturação, possivelmente devido à variabilidade da microbiota verificada nas diferentes estações. No tocante às características microbiológicas, observou-se que, durante o período de maturação, 95% dos queijos confeccionados nas diferentes condições apresentaram padrões de qualidade em conformidade com o estabelecido na legislação, no que se refere às concentrações de coliformes termotolerantes, estafilococos coagulase positivos, Salmonella sp e Listeria sp independentemente da incorporação das culturas probióticas. Entretanto, a adição das culturas probióticas reduziu a carga microbiana de gêneros da família Enterobacter iaceae , em especial Enterobacter , Citrobacter , Klebsiella , Kluyvera e Obesumbacterium durante processo de maturação. Especificamente, o emprego das culturas probióticas resultou em redução do percentual total de Enterobacter iaceae na microbiota dos queijos de 0,41% para 0,17% no verão, e de 12,42% para 6,71% no outono. Neste contexto, a adição de culturas probióticas pode constituir alternativa viável para melhoria da qualidade microbiológica de queijos elaborados com leite cru por meio do incremento do potencial antagônico da microbiota sobre espécies de micro-organismos potencialmente patogênicos, toxigênicos e deteriorantes, além de agregar valor ao produto final. / Artisanal cheeses, made with raw milk, are appreciated for their sensorial profiles, which differentiates them from industrialized cheeses. In order to ensure safety to consumers, Brazilian legislation established microbiological standards for these products. Probiotics are well known for their ability to favorably modulate the host\'s microbiota by producing antimicrobial compounds, mainly organic acids and bacteriocins. Therefore, this study aimed to evaluate the use of probiotic microorganisms as an alternative to improve the microbiological quality of artisanal cheeses through inhibition of contaminating microorganisms, using Mantiqueira Highlands Artisanal Cheese as a model. To do so, a preparation consisting of 16 probiotic strains was added to the milk, at a final concentration of 3x106 CFU/ml. Additionally, the effects of this practice on pH, carbohydrates and organic acids concentrations over a 45 day ripening period were evaluated. Analyses of cheese bacterial community composition were also undertaken by means of 16S rRNA gene pyrosequencing. The strategy consisted of comparing cheeses made with probiotic cultures with a control group, to which no probiotic culture was added. Over a 45 day ripening period, in three seasons (winter, summer and autumn), samples were collected at days 1, 15, 30 and 45 in order to conduct pH, moisture, carbohydrate, organic acids, microbiological and pyrosequencing analyses. The results showed that the addition of probiotic cultures resulted in distinct effects in the different seasons regarding carbohydrate and organic acids concentrations, possibly due to variability in bacterial community composition. The results also demonstrated that 95% of cheeses were deemed acceptable according to Brazilian law regarding coliforms, positive coagulase staphylococci, Salmonella sp. and Listeria sp, regardless of adding probiotics. However, the incorporation of probiotic microorganisms resulted in reduced populations of genera belonging to Enterobacteriaceae family, especially Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Kluyvera and Obesumbacterium, throughout the whole ripening process. Specifically, the addition of probiotic cultures reduced the total percentage of Entercobacteriaceae from 0,41% to 0,17% in the summer, and from 12,42% to 6,71% in the fall. In this context, the use of probiotic microorganisms may represent a viable alternative for improving microbiological quality of raw milk cheeses by means of incrementing the antagonistic potential of cheese microbiota towards potentially pathogenic and toxigenic microorganisms.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5442.pdf: 24447413 bytes, checksum: 0fb87e9809105da0cdcac9e0a602e588 (MD5) Previous issue date: 2013-07-03 / Financiadora de Estudos e Projetos / The occurrence of nuisance phytoplankton blooms is a worldwide problem that affects water quality and other aquatic biota. Bacterial (non-cyanobacterial) communities can influence and interfere with the formation, maintenance and termination of such blooms via many biotic interactions. The bacterial communities associated with 3 bloom forming phytoplankton species, the Cyanobacteria Microcystis aeruginosa and Cylindrospermopsis raciborskii and the diatom Aulacoseira granulata, were assessed by the 454-Pyrosequencing of 16S rRNA gene amplicons (V3-V5 regions). The aims of this work were to verify if different bacterial communities would develop with different host species, or in different fractions (attached and free-living bacteria) and different growth phases (physiological state) of each phytoplankton species. Still using pyrosequencing data, the strength of phytoplankton-bacteria association was analyzed for M. aeruginosa and A. granulata by culturing the phytoplankton species with different bacterial inocula (and growth medium for the cyanobacteria). Furthermore, the effects of bacterial strains isolated from attached community of A. granulata and M. aeruginosa cultures were tested on the growth of the phytoplankton species. Significantly different bacterial communities developed: i) in response to physiological state and between fractions of the same phytoplankton culture, and ii) in response to the different host phytoplankton species, with major differences in the proportion of the OTUs between phytoplankton cultures rather than in the absence or presence of specific bacterial taxa. Differences between experiments significantly changed the BCC that developed associated with the same host species. However, some bacterial OTUs were found associated with the same phytoplankton species in different experiments, suggesting a tight association with the host species. Most of the strains either isolated from M. aeruginosa or from A. granulata affected negatively the growth of the diatom. However, the isolated strains had no effect on the cyanobacterial growth, suggesting the importance of bacterial community to the dominance of M. aeruginosa on Barra Bonita Reservoir, at least concerning to the competition with A. granulata. / A ocorrência de florações fitoplanctônicas é um problema mundial e que afeta a qualidade da água e a biota aquática. A comunidade bacteriana pode influenciar e interferir na formação, manutenção e término de tais florações por meio de diversas interações bióticas. Neste trabalho, por meio do sequenciamento massivo (pirossequenciamento) das regiões V3-V5 do gene RNAr 16S, foram caracterizadas as comunidades bacterianas associadas a 3 espécies fitoplanctônicas formadoras de blooms: as cianobactérias Microcystis aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii e a diatomácea Aulacoseira granulata. Os objetivos do trabalho foram verificar se diferentes comunidades bacterianas desenvolvem-se com diferentes espécies hospedeiras ou em diferentes frações (aderidas e livres) e fases de crescimento (estados fisiológicos) de cada espécie fitoplanctônica. Ainda utilizando os dados de pirossequenciamento, a consistência dessas associações foi testada para M. aeruginosa e A. granulata por meio do cultivo de cada espécie fitoplanctônica com diferentes inóculos bacterianos (e meio de cultura para a cianobactéria). Além disso, os efeitos de bactérias aderidas isoladas de A. granulata e M. aeruginosa foram testados sobre o crescimento de ambas as espécies fitoplanctônicas. Comunidades bacterianas significativamente diferentes se desenvolveram: i) em resposta ao estado fisiológico e entre diferentes frações da mesma espécie fitoplanctônica, e ii) em resposta às diferentes espécies fitoplanctônicas hospedeiras, com maiores diferenças na proporção das UTOs (unidades taxonômicas operacionais) do que na presença/ausência de UTOs específicas. Diferenças entre experimentos (e inóculos bacterianos) alteraram significativamente a composição da comunidade bacteriana associada a uma mesma espécie fitoplanctônica. Algumas UTOs foram recorrentes nos diferentes experimentos, sugerindo uma associação mais consistente com a espécie hospedeira. A maioria das linhagens bacterianas isoladas de M. aeruginosa ou de A. granulata afetou negativamente o crescimento da diatomácea. No entanto, nenhuma linhagem ou mistura de linhagens apresentou efeito sobre a cianobactéria durante seu crescimento exponencial, sugerindo a importância da comunidade bacteriana para a dominância de M. aeruginosa no reservatório de Barra Bonita, ao menos em relação à competição com A. granulata.

Foi realizado o pirossequenciamento de duas bibliotecas de cDNA do intestino médio de Tenebrio molitor e as sequências foram submetidos à montagem através do programa Newbler. Visando sanar alguns questionamentos a respeito de muitos tipos de transportadores que pudessem estar envolvidos com funções presumíveis em tamponamento luminal, absorção de nutrientes, envolvimento em mecanismos de secreção de enzimas como a α-manosidases e secreção e absorção de água, foram analisadas sequências de interesse que pudessem esclarecer os fenômenos fisiológicos em questão. O pirossequenciamento revelou 19 sequencias de α-manosidases. Após alinhamentos múltiplos, desconfiou-se que o contig 12 era a continuação da sequência original da α-manosidase. Utilizando-se de iniciadores apropriados, a suspeita foi confirmada e uma sequência completa foi obtida e denominada de TmMan1. Através de cladogramas gerados com as sequências de todos os contigs obtidos, assim como de sequências representativas das famílias 38 e 47 das glicosídeos hidrolases, mostrou que todas a nossas sequências, exceto o contig 6 e 7, pertencem à família 38. Todas as sequências com mais de 100 reads (exceto o contig 9) tiveram a sua expressão tecidual avaliada por RT-PCR. Os resultados mostraram que só são expressos no intestino ou intestino e túbulo de Malpighi, implicando na possibilidade de serem digestivas. Dessas sequências, as únicas com peptídeo sinal são a TmMan1 (contig 12) e o contig 14 e, portanto, devem corresponder às atividades Man1 e Man2. Levando em conta o número de reads, TmMan1 deveria corresponder a Man2 e o contig 14 à Man1. É possível, embora necessite de confirmação, que os contigs 8 e 15 sejam de expressão lisossômica. Um peptídeo sintetizado que correspondia a sequencia única da TmMan1 foi usado para gerar anticorpos, que reconheceram a Man2, mas não a Man1, confirmando a identificação de TmMan1 com a Man2. Esse anticorpo foi também utilizado para imunolocalizar a TmMan1 nas células intestinais de T. molitor. Os resultados mostraram que a TmMan1 é secretada de forma apócrina pela região anterior de intestino de T. molitor. Esse trabalho é o primeiro que mostra a ocorrência de α-manosidases com especificidade similar àquelas lissossômicas, mas que são secretadas apócrinamente para fora da célula, devendo agir no lúmen intestinal, removendo resíduos de manoses de oligossacarídeos manosilados. Foram identificados 10 tipos diferentes de transportadores e na elaboração dos modelos fisiológicos só foram levados em conta aqueles expressos exclusivamente no intestino médio ou no intestino médio e túbulos de Malpighi. A V-ATPase em T.molitor parece ser uma bomba usada para energizar muitos dos transportes ao longo do intestino médio como, por exemplo, o de oligopeptídeos. Já as bombas de Na+ e K+ são responsáveis pelo equilíbrio de cargas e, portanto estão presentes na maioria dos tipos celulares. Duas sequências de cotransportadores de oligopeptídeos/H+ foram encontradas no pirossequenciamento e sua expressão é maior na região posterior, uma vez que ali é a última possibilidade de absorção dos oligopeptídeos que ainda estiverem no lúmen, remanescentes da digestão final de proteínas. Foi demonstrado que T.Molitor absorve aminoácidos e açúcares ao longo de todo o intestino médio, pois estes tipos de transportadores possuem uma expressão uniforme ao longo do intestino médio. Já a expressão dos transportadores de NH3/NH4+ em T.molitor, encontra-se confinada ás regiões onde o pH do intestino médio do inseto é mais ácida. Também há uma expressão de transportadores de cloreto que se manifesta mais intensamente na região anterior. Podemos visualizar que a distribuição dos contigs dos transportadores de bicarbonato encontra-se mais expressiva na região posterior do intestino médio. Os resultados sugerem que a acidificação na região anterior do intestino de T.molitor pode resultar da secreção de NH4+ acompanhado do íon cloreto e a alcalinização na região posterior do lançamento no lúmen de bicarbonato. A importância dos canais de cloreto é que o mesmo balanceia as cargas e desta forma pode ser útil juntamente com o transporte de NH4+, que gera uma carga no lado onde é transportado. Há absorvição de água (junto com glicose) ao longo de todo o intestino médio, enquanto que a secreção de água ocorreria apenas nos dois terços finais do intestino médio com o auxílio de aquaporinas complementado por transportadores de íons, teria como consequência a abosorção líquida de água na região anterior e uma secreção líquida no final do intestino médio. Isso esclarece qual a base molecular para a ocorrência do contrafluxo intestinal evidenciado por experimentos fisiológicos. / Pyrosequencing was performed with two cDNA libraries in the midgut of Tenebrio molitor and the sequences were subjected to assembly with the Newbler program. In order to tackle questions concerning proteins which may be involved in midgut buffering, nutrient absorption, in the secretion of enzymes such as α-mannosidases , and water absorption and secretion, sequences of interest were analyzed in order to clarify those physiological phenomena. The pyrosequencing revealed 19 sequences of α- mannosidases . After multiple alignments, it was suspected that the contig 12 was the continuation of the original sequence of the α-mannosidase. Using appropriate primers, the hypothesis was confirmed and a complete sequence was obtained and named TmMan . Through cladograms generated from the sequences of the contigs obtained, as well as of sequences representing families 38 and 47 of glycoside hydrolases, it was showed that all sequences except the contig 6 and 7 belong to family 38. All sequences with over 100 reads (except contig 9) had their tissue expression assessed by RT-PCR. The results showed that they are expressed only in the midgut or midgut and Malpighian tubules, implying the possibility of having a digestive function. Among these sequences, the only ones with a signal peptide are TmMan1 (contig 12) and contig 14 and therefore they should correspond to the activities Man1 and Man2. Taking into account the number of reads, TmMan1 should correspond to Man2 and contig 14 to Man1. It is possible, though it requires confirmation, that the contigs 8 and 15 are lysosomal. A peptide corresponding to the unique sequence TmMan1 was synthesized and used to generate antibodies that recognized Man2 , but not Man1, confirming the identification of TmMan1 with Man2. This antibody was also used to immunolocalyze TmMan1 in the midgut cells of T. molitor. The results showed that TmMan1 is secreted in an apocrine way by the anterior region of T. molitor midgut. This is the first study that shows the occurrence of α-mannosidases with similar specificity to those lysosomal, but that are secreted in an apocrine way, acting in the midgut lumen, removing mannoses from mannosylated oligosaccharides. We identified 10 different types of carriers and in the development of physiological models it was only taken into account those expressed exclusively in the midgut or midgut and Malpighian tubules . The V- ATPase in T.molitor appears to be a pump used for powering many transports along the midgut, as of oligopeptides. The Na+ and K+ pumps are responsible for charge load balancing and therefore are present in most cell types. Two sequences of oligopeptide / H+ cotransporters were found in the transcriptome and their expression is higher in the posterior region. This agrees with the fact that there is the last possibility of oligopeptides remaining in the lumen to be absorbed. It is highly probable that T.molitor absorbs amino acids and sugars throughout the midgut, once these types of carriers have a uniform expression throughout the midgut . The expression of NH3/NH4+ transporters in T.molitor is confined to the regions where the pH of the insect midgut is more acidic. There is also chloride transporter expression there. The expression of bicarbonate transporters is more significant in the posterior midgut. The results suggest that acidification in the anterior T.molitor midgut may result from the secretion of NH4+ and chloride ions together, whereas the alkalization in the posterior midgut results from bicarbonate release. There is water absortion (along with glucose) throughout the midgut , while the water secretion occurs only in the final two-thirds of the midgut with the aid of aquaporins, complemented by ion transporters. It would result in the net absorption and net secretion of water in the anterior and postertior midgut, respectively. This clarifies the molecular basis of the midgut countercurrent fluxes evidenced by physiological experiments.

Foi realizado o pirossequenciamento de duas bibliotecas de cDNA do intestino médio de Tenebrio molitor e as sequências foram submetidos à montagem através do programa Newbler. Visando sanar alguns questionamentos a respeito de muitos tipos de transportadores que pudessem estar envolvidos com funções presumíveis em tamponamento luminal, absorção de nutrientes, envolvimento em mecanismos de secreção de enzimas como a α-manosidases e secreção e absorção de água, foram analisadas sequências de interesse que pudessem esclarecer os fenômenos fisiológicos em questão. O pirossequenciamento revelou 19 sequencias de α-manosidases. Após alinhamentos múltiplos, desconfiou-se que o contig 12 era a continuação da sequência original da α-manosidase. Utilizando-se de iniciadores apropriados, a suspeita foi confirmada e uma sequência completa foi obtida e denominada de TmMan1. Através de cladogramas gerados com as sequências de todos os contigs obtidos, assim como de sequências representativas das famílias 38 e 47 das glicosídeos hidrolases, mostrou que todas a nossas sequências, exceto o contig 6 e 7, pertencem à família 38. Todas as sequências com mais de 100 reads (exceto o contig 9) tiveram a sua expressão tecidual avaliada por RT-PCR. Os resultados mostraram que só são expressos no intestino ou intestino e túbulo de Malpighi, implicando na possibilidade de serem digestivas. Dessas sequências, as únicas com peptídeo sinal são a TmMan1 (contig 12) e o contig 14 e, portanto, devem corresponder às atividades Man1 e Man2. Levando em conta o número de reads, TmMan1 deveria corresponder a Man2 e o contig 14 à Man1. É possível, embora necessite de confirmação, que os contigs 8 e 15 sejam de expressão lisossômica. Um peptídeo sintetizado que correspondia a sequencia única da TmMan1 foi usado para gerar anticorpos, que reconheceram a Man2, mas não a Man1, confirmando a identificação de TmMan1 com a Man2. Esse anticorpo foi também utilizado para imunolocalizar a TmMan1 nas células intestinais de T. molitor. Os resultados mostraram que a TmMan1 é secretada de forma apócrina pela região anterior de intestino de T. molitor. Esse trabalho é o primeiro que mostra a ocorrência de α-manosidases com especificidade similar àquelas lissossômicas, mas que são secretadas apócrinamente para fora da célula, devendo agir no lúmen intestinal, removendo resíduos de manoses de oligossacarídeos manosilados. Foram identificados 10 tipos diferentes de transportadores e na elaboração dos modelos fisiológicos só foram levados em conta aqueles expressos exclusivamente no intestino médio ou no intestino médio e túbulos de Malpighi. A V-ATPase em T.molitor parece ser uma bomba usada para energizar muitos dos transportes ao longo do intestino médio como, por exemplo, o de oligopeptídeos. Já as bombas de Na+ e K+ são responsáveis pelo equilíbrio de cargas e, portanto estão presentes na maioria dos tipos celulares. Duas sequências de cotransportadores de oligopeptídeos/H+ foram encontradas no pirossequenciamento e sua expressão é maior na região posterior, uma vez que ali é a última possibilidade de absorção dos oligopeptídeos que ainda estiverem no lúmen, remanescentes da digestão final de proteínas. Foi demonstrado que T.Molitor absorve aminoácidos e açúcares ao longo de todo o intestino médio, pois estes tipos de transportadores possuem uma expressão uniforme ao longo do intestino médio. Já a expressão dos transportadores de NH3/NH4+ em T.molitor, encontra-se confinada ás regiões onde o pH do intestino médio do inseto é mais ácida. Também há uma expressão de transportadores de cloreto que se manifesta mais intensamente na região anterior. Podemos visualizar que a distribuição dos contigs dos transportadores de bicarbonato encontra-se mais expressiva na região posterior do intestino médio. Os resultados sugerem que a acidificação na região anterior do intestino de T.molitor pode resultar da secreção de NH4+ acompanhado do íon cloreto e a alcalinização na região posterior do lançamento no lúmen de bicarbonato. A importância dos canais de cloreto é que o mesmo balanceia as cargas e desta forma pode ser útil juntamente com o transporte de NH4+, que gera uma carga no lado onde é transportado. Há absorvição de água (junto com glicose) ao longo de todo o intestino médio, enquanto que a secreção de água ocorreria apenas nos dois terços finais do intestino médio com o auxílio de aquaporinas complementado por transportadores de íons, teria como consequência a abosorção líquida de água na região anterior e uma secreção líquida no final do intestino médio. Isso esclarece qual a base molecular para a ocorrência do contrafluxo intestinal evidenciado por experimentos fisiológicos. / Pyrosequencing was performed with two cDNA libraries in the midgut of Tenebrio molitor and the sequences were subjected to assembly with the Newbler program. In order to tackle questions concerning proteins which may be involved in midgut buffering, nutrient absorption, in the secretion of enzymes such as α-mannosidases , and water absorption and secretion, sequences of interest were analyzed in order to clarify those physiological phenomena. The pyrosequencing revealed 19 sequences of α- mannosidases . After multiple alignments, it was suspected that the contig 12 was the continuation of the original sequence of the α-mannosidase. Using appropriate primers, the hypothesis was confirmed and a complete sequence was obtained and named TmMan . Through cladograms generated from the sequences of the contigs obtained, as well as of sequences representing families 38 and 47 of glycoside hydrolases, it was showed that all sequences except the contig 6 and 7 belong to family 38. All sequences with over 100 reads (except contig 9) had their tissue expression assessed by RT-PCR. The results showed that they are expressed only in the midgut or midgut and Malpighian tubules, implying the possibility of having a digestive function. Among these sequences, the only ones with a signal peptide are TmMan1 (contig 12) and contig 14 and therefore they should correspond to the activities Man1 and Man2. Taking into account the number of reads, TmMan1 should correspond to Man2 and contig 14 to Man1. It is possible, though it requires confirmation, that the contigs 8 and 15 are lysosomal. A peptide corresponding to the unique sequence TmMan1 was synthesized and used to generate antibodies that recognized Man2 , but not Man1, confirming the identification of TmMan1 with Man2. This antibody was also used to immunolocalyze TmMan1 in the midgut cells of T. molitor. The results showed that TmMan1 is secreted in an apocrine way by the anterior region of T. molitor midgut. This is the first study that shows the occurrence of α-mannosidases with similar specificity to those lysosomal, but that are secreted in an apocrine way, acting in the midgut lumen, removing mannoses from mannosylated oligosaccharides. We identified 10 different types of carriers and in the development of physiological models it was only taken into account those expressed exclusively in the midgut or midgut and Malpighian tubules . The V- ATPase in T.molitor appears to be a pump used for powering many transports along the midgut, as of oligopeptides. The Na+ and K+ pumps are responsible for charge load balancing and therefore are present in most cell types. Two sequences of oligopeptide / H+ cotransporters were found in the transcriptome and their expression is higher in the posterior region. This agrees with the fact that there is the last possibility of oligopeptides remaining in the lumen to be absorbed. It is highly probable that T.molitor absorbs amino acids and sugars throughout the midgut, once these types of carriers have a uniform expression throughout the midgut . The expression of NH3/NH4+ transporters in T.molitor is confined to the regions where the pH of the insect midgut is more acidic. There is also chloride transporter expression there. The expression of bicarbonate transporters is more significant in the posterior midgut. The results suggest that acidification in the anterior T.molitor midgut may result from the secretion of NH4+ and chloride ions together, whereas the alkalization in the posterior midgut results from bicarbonate release. There is water absortion (along with glucose) throughout the midgut , while the water secretion occurs only in the final two-thirds of the midgut with the aid of aquaporins, complemented by ion transporters. It would result in the net absorption and net secretion of water in the anterior and postertior midgut, respectively. This clarifies the molecular basis of the midgut countercurrent fluxes evidenced by physiological experiments.

As lagoas salino-alcalinas (salinas) da sub-região Nhecolândia do Pantanal, Mato Grosso do Sul, combinam valores de pH elevados com a presença de altas concentrações de sal, assemelhando-se aos lagos de soda da África Oriental. O entendimento atual dos mecanismos físicos, químicos e biológicos nestes ambientes extremos do Brasil é limitado. Embora os micro-organismos estejam envolvidos nos processos biogeoquímicos em ecossistemas aquáticos, investigações sobre os grupos bacterianos que contribuem para a diversidade e funções específicas nessas salinas inexistem. Assim, a presente dissertação centrou-se na avaliação da comunidade bacteriana de duas salinas (Salina Verde e Salina Preta), localizadas na sub-região da Nhecolândia. Especificamente, investigou-se a diversidade e a estrutura das comunidades bacterianas, os perfis metabólicos das lagoas e genes funcionais que codificam enzimas relacionadas a transformação do nitrogênio, mercúrio, selênio e arsênio. As amostras de água foram coletadas durante a estação seca (setembro de 2012) na Salina Verde (pH 9,5, E.C. 2575 mS cm-1), caracterizada pela presença constante de floração de cianobactérias e na Salina Preta (pH 8,9, E.C. 1500 mS cm-1), sem registro de ocorrência de floração. As amostragens foram realizadas em triplicatas em duas profundidades (superfície e fundo) e duas vezes no dia (10:00 h e 15:00 h) devido à ocorrência natural de saturação de oxigênio observada na Salina Verde. O DNA total de cada amostra ambiental foi extraído e a diversidade bacteriana e funcionalidade foram acessadas por pirosequenciamento do gene de 16S RNAr e sequenciamento metagenômico. A análise de PCR quantitativa do gene de 16S RNAr foi realizada de forma a quantificar a comunidade bacteriana. A abundância bacteriana foi maior na Salina Verde do que na Salina Preta (1010 e 109 cópias mL-1, respectivamente). As sequências parciais do gene de 16S RNAr obtidas no pirosequenciamento mostraram a dominância de táxons do gênero Anabaenopsis sp. na floração da Salina Verde, englobando até 92% do total de sequências. A comunidade bacteriana da Salina Preta apresentou os maiores índices de diversidade e riqueza, sendo dominantes os filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria e Verrucomicrobia. Apenas a Salina Preta mostrou diferenças na comunidade bacteriana de acordo com as profundidades amostradas. Na superfície desta lagoa, os filos Actinobacteria e Verrucomicrobia predominaram, enquanto no fundo, prevaleceram os filos Proteobacteria e Chlamydiae. A temperatura foi detectada como o fator abiótico que influenciou a heterogeneidade espacial da Salina Preta. Por sua vez, a alcalinidade e o pH foram os fatores que impulsionaram as diferenças e variações das comunidades bacterianas em ambas as lagoas. Genes bacterianos envolvidos nos ciclos biogeoquímicos do nitrogênio, mercúrio e arsênio foram encontrados nas salinas Verde e Preta, sugerindo uma elevada redundância funcional nas transformações desses elementos. Não foram encontrados genes microbianos envolvidos no ciclo do selênio. Os dados gerados revelaram uma comunidade microbiana taxonômica e funcionalmente complexa que habita as salinas. Os resultados deste estudo fornecem uma avaliação aprofundada baseada em abordagens independentes de cultivo, sendo este um passo importante na compreensão da dinâmica funcional desses ambientes no Pantanal brasileiro. / The saline-alkaline lakes (salinas) of the Nhecolândia sub-region of the Pantanal, Mato Grosso do Sul state, combine high pH values with the presence of high salt concentrations, resembling the soda lakes of East Africa. The current understanding of physical, chemical and biological mechanisms in these extreme environments is limited. Although microorganisms are involved in biogeochemical processes in aquatic ecosystem, researches on the bacterial groups that contribute to diversity and specific functions in these salinas are scarce. This dissertation therefore focused on the evaluation of bacterial community of two salinas (Salina Verde and Salina Preta) located in the Nhecolândia subregion. Specifically, it was investigated the diversity and structure of bacterial communities, the metabolic profile of the lakes and functional genes that encode the nitrogen, mercury and arsenic-transforming enzymes. Water samples were collected during the dry season (September 2012) from Salina Verde (pH 9.5, E.C. 2575 mS cm-1), characterized by constant presence of cyanobacterial bloom, and from Salina Preta (pH 8.9, E.C. 1500 mS cm-1), with no report of bloom occurrence. Triplicate samplings were carried out in two depths (surface and bottom) and twice a day (10 AM and 3 PM) due to naturally occurrence of oxygen saturation, observed at Salina Verde. Total DNA of each environmental sample was extracted and bacterial diversity and functionality were accessed by 16S rRNA gene pyrosequencing and metagenomic sequencing. Analysis of quantitative PCR of the 16S rRNA gene was performed in order to quantify the bacterial community. Bacterial abundance was higher in the Salina Verde than in the Salina Preta (1010 and 109 copies mL-1, respectively). The partial sequences of the 16S rRNA gene obtained in the pyrosequencing revealed the genus Anabaenopsis sp. as the dominant taxa in the Salina Verde bloom, encompassing up to 92% of the total bacteria. Bacterial community of the Salina Preta showed the highest diversity and richness index, with dominant phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria and Verrucomicrobia. Only the Salina Preta showed differences in bacterial community in accordance with the depths sampled. On the surface of this lake, the phyla Actinobacteria and Verrucomicrobia predominated, while in the bottom, Proteobacteria and Chlamydiae prevailed. The temperature was detected as the abiotic factor influencing the spatial heterogeneity at Salina Preta. On the other hand, alkalinity and pH were the factors driving the differences and variation of bacterial community in both lakes. Bacterial genes involved in the biogeochemical cycles of nitrogen, mercury and arsenic were found in Salina Verde and Salina Preta, suggesting a high metabolic redundancy in the transformation these elements. No microbial genes involved in selenium cycle were found. The data showed a taxonomic and functional complex microbial community inhabiting salinas. The results of this study provide a detailed assessment based on culture-independent approaches, which is a stepping stone to understand the functional dynamics of these environments in the Brazilian Pantanal.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

As lagoas salino-alcalinas (salinas) da sub-região Nhecolândia do Pantanal, Mato Grosso do Sul, combinam valores de pH elevados com a presença de altas concentrações de sal, assemelhando-se aos lagos de soda da África Oriental. O entendimento atual dos mecanismos físicos, químicos e biológicos nestes ambientes extremos do Brasil é limitado. Embora os micro-organismos estejam envolvidos nos processos biogeoquímicos em ecossistemas aquáticos, investigações sobre os grupos bacterianos que contribuem para a diversidade e funções específicas nessas salinas inexistem. Assim, a presente dissertação centrou-se na avaliação da comunidade bacteriana de duas salinas (Salina Verde e Salina Preta), localizadas na sub-região da Nhecolândia. Especificamente, investigou-se a diversidade e a estrutura das comunidades bacterianas, os perfis metabólicos das lagoas e genes funcionais que codificam enzimas relacionadas a transformação do nitrogênio, mercúrio, selênio e arsênio. As amostras de água foram coletadas durante a estação seca (setembro de 2012) na Salina Verde (pH 9,5, E.C. 2575 mS cm-1), caracterizada pela presença constante de floração de cianobactérias e na Salina Preta (pH 8,9, E.C. 1500 mS cm-1), sem registro de ocorrência de floração. As amostragens foram realizadas em triplicatas em duas profundidades (superfície e fundo) e duas vezes no dia (10:00 h e 15:00 h) devido à ocorrência natural de saturação de oxigênio observada na Salina Verde. O DNA total de cada amostra ambiental foi extraído e a diversidade bacteriana e funcionalidade foram acessadas por pirosequenciamento do gene de 16S RNAr e sequenciamento metagenômico. A análise de PCR quantitativa do gene de 16S RNAr foi realizada de forma a quantificar a comunidade bacteriana. A abundância bacteriana foi maior na Salina Verde do que na Salina Preta (1010 e 109 cópias mL-1, respectivamente). As sequências parciais do gene de 16S RNAr obtidas no pirosequenciamento mostraram a dominância de táxons do gênero Anabaenopsis sp. na floração da Salina Verde, englobando até 92% do total de sequências. A comunidade bacteriana da Salina Preta apresentou os maiores índices de diversidade e riqueza, sendo dominantes os filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria e Verrucomicrobia. Apenas a Salina Preta mostrou diferenças na comunidade bacteriana de acordo com as profundidades amostradas. Na superfície desta lagoa, os filos Actinobacteria e Verrucomicrobia predominaram, enquanto no fundo, prevaleceram os filos Proteobacteria e Chlamydiae. A temperatura foi detectada como o fator abiótico que influenciou a heterogeneidade espacial da Salina Preta. Por sua vez, a alcalinidade e o pH foram os fatores que impulsionaram as diferenças e variações das comunidades bacterianas em ambas as lagoas. Genes bacterianos envolvidos nos ciclos biogeoquímicos do nitrogênio, mercúrio e arsênio foram encontrados nas salinas Verde e Preta, sugerindo uma elevada redundância funcional nas transformações desses elementos. Não foram encontrados genes microbianos envolvidos no ciclo do selênio. Os dados gerados revelaram uma comunidade microbiana taxonômica e funcionalmente complexa que habita as salinas. Os resultados deste estudo fornecem uma avaliação aprofundada baseada em abordagens independentes de cultivo, sendo este um passo importante na compreensão da dinâmica funcional desses ambientes no Pantanal brasileiro. / The saline-alkaline lakes (salinas) of the Nhecolândia sub-region of the Pantanal, Mato Grosso do Sul state, combine high pH values with the presence of high salt concentrations, resembling the soda lakes of East Africa. The current understanding of physical, chemical and biological mechanisms in these extreme environments is limited. Although microorganisms are involved in biogeochemical processes in aquatic ecosystem, researches on the bacterial groups that contribute to diversity and specific functions in these salinas are scarce. This dissertation therefore focused on the evaluation of bacterial community of two salinas (Salina Verde and Salina Preta) located in the Nhecolândia subregion. Specifically, it was investigated the diversity and structure of bacterial communities, the metabolic profile of the lakes and functional genes that encode the nitrogen, mercury and arsenic-transforming enzymes. Water samples were collected during the dry season (September 2012) from Salina Verde (pH 9.5, E.C. 2575 mS cm-1), characterized by constant presence of cyanobacterial bloom, and from Salina Preta (pH 8.9, E.C. 1500 mS cm-1), with no report of bloom occurrence. Triplicate samplings were carried out in two depths (surface and bottom) and twice a day (10 AM and 3 PM) due to naturally occurrence of oxygen saturation, observed at Salina Verde. Total DNA of each environmental sample was extracted and bacterial diversity and functionality were accessed by 16S rRNA gene pyrosequencing and metagenomic sequencing. Analysis of quantitative PCR of the 16S rRNA gene was performed in order to quantify the bacterial community. Bacterial abundance was higher in the Salina Verde than in the Salina Preta (1010 and 109 copies mL-1, respectively). The partial sequences of the 16S rRNA gene obtained in the pyrosequencing revealed the genus Anabaenopsis sp. as the dominant taxa in the Salina Verde bloom, encompassing up to 92% of the total bacteria. Bacterial community of the Salina Preta showed the highest diversity and richness index, with dominant phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria and Verrucomicrobia. Only the Salina Preta showed differences in bacterial community in accordance with the depths sampled. On the surface of this lake, the phyla Actinobacteria and Verrucomicrobia predominated, while in the bottom, Proteobacteria and Chlamydiae prevailed. The temperature was detected as the abiotic factor influencing the spatial heterogeneity at Salina Preta. On the other hand, alkalinity and pH were the factors driving the differences and variation of bacterial community in both lakes. Bacterial genes involved in the biogeochemical cycles of nitrogen, mercury and arsenic were found in Salina Verde and Salina Preta, suggesting a high metabolic redundancy in the transformation these elements. No microbial genes involved in selenium cycle were found. The data showed a taxonomic and functional complex microbial community inhabiting salinas. The results of this study provide a detailed assessment based on culture-independent approaches, which is a stepping stone to understand the functional dynamics of these environments in the Brazilian Pantanal.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.