A leucemia linfoide aguda (LLA) compreende um grupo heterogêneo de neoplasias caracterizadas por proliferação anormal e acúmulo de células imaturas na medula óssea, o que prejudica a produção de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O fator de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like growth factor 1; IGF1) e seu receptor (IGF1R) regulam o crescimento celular normal e contribuem para a transformação e crescimento de células malignas através da ativação de vias de sinalização intracelular. A via de sinalização do IGF1 é iniciada através da ativação de seu receptor seguido da ativação de seus substratos, incluindo o substrato 1 do receptor de insulina (insulin receptor substrate 1; IRS1). IRS1 é uma proteína predominantemente citosólica envolvida na transdução de sinal, e também desempenha um papel na transformação maligna, sendo altamente expresso em muitos tipos de câncer. Em fibroblastos de camundongos, Irs1, através da sinalização do Igf1, foi descoberto como uma proteína chave para a translocação nuclear da ?-catenina e ativação da transcrição de seus genes alvos, como o Myc e a ciclina D1. MYC e ciclina D1 podem atuar como oncogenes, contribuindo para o desenvolvimento de diversas neoplasias, inclusive as hematopoéticas. Deste modo, o objetivo deste projeto de pesquisa foi investigar a participação do IRS1 nuclear na via da ?-catenina em LLA. Foram utilizadas no estudo linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa) e células hematopoéticas primárias de doadores normais (n=13) e de pacientes adultos com LLA (n=45) atendidos em nossa Instituição. Estudos de expressão gênica (PCRq), expressão, associação proteica (western blotting, imunoprecipitação) e localização celular (fracionamento subcelular e microscopia confocal) foram utilizados. Células da linhagem Jurkat foram submetidas à estimulação com IGF1 e/ou inibição farmacológica de IGF1R (OSI-906). Observamos elevada expressão gênica relativa de IRS1, ?-catenina e MYC nos pacientes com LLA quando comparada aos controles normais (p<0,05), mas não houve diferença na expressão gênica de ciclina D1 e IGF1R entre os dois grupos. Observamos uma correlação positiva entre a expressão gênica de ?-catenina e MYC (p=0.0004; r=0.50), e entre a expressão de IRS1 e MYC (p=0.001; r=0.45) na coorte de pacientes com LLA. Na análise univariada, idade e expressão de MYC correlacionaram-se negativamente com a sobrevida global de pacientes com LLA; idade foi fator independente de prognóstico para a sobrevida. Em linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa), observamos co-localização de IRS1 e ?-catenina no núcleo e no citoplasma. Em células primárias de doador normal, IRS1 e ?-catenina localizaram-se predominantemente no citoplasma. Em células da linhagem celular Jurkat, observamos interação entre IRS1 e ?- catenina e o estímulo com IGF1 provocou o aumento da fosforilação em tirosina de IRS1. O tratamento com OSI-906 diminuiu a fosforilação em tirosina de IGF1R, a translocação nuclear de ?-catenina e a expressão proteica de MYC em células Jurkat. Em conclusão, nossos dados suportam uma relação entre a via de sinalização IGF1R/IRS1 e a ativação da ?- catenina em leucemia linfoide aguda, o que pode representar um importante eixo de sinalização envolvido na fisiopatologia da doença. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of malignancies characterized by abnormal proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow, which impairs the production of erythrocytes, leukocytes and platelets. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) and its receptor (IGF1R) regulate normal cell growth and contribute to transformation and growth of malignant cells through activation of downstream signaling pathways. The IGF1 signaling pathway is initiated through activation of its receptor followed by activation of its substrates, including insulin receptor substrate 1 (IRS1). IRS1 is well known as a cytosolic protein involved in signal transduction, but also plays a role in malignant transformation, being highly expressed in many cancers. In mouse fibroblasts, Irs1, through Igf1 signaling, was found to be the key protein for nuclear translocation of ?-catenin and transcription activation of its target genes, such as Myc and cyclin D1. MYC and cyclin D1 may act as oncogenes, contributing to the development of cancers, including hematopoietic neoplasm. Thus, the aims of this study were to investigate the role of nuclear IRS1 in the ?-catenin pathway in LLA. We used in the study ALL cell lines (Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji) and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=13) and from adult patients with ALL (n=45) treated at our Institution. Studies of gene expression (qPCR), protein expression, association (Western blotting and immunoprecipitation) and cell location (subcellular fractionation and confocal microscopy) were used. Jurkat cells were submitted to IGF1 stimulation and/or IGF1R pharmacological inhibition (OSI-906). IRS1, ?-catenin and MYC relative gene expression were significantly elevated in ALL patients compared to normal controls (p<0.05), but there was no difference in gene expression of cyclin D1 and IGF1R between the two groups. A positive correlation between ?-catenin and MYC relative expression (p=0.0004; r=0.50) and between IRS1 and MYC expression (p=0.001; r=0.45) was found. Univariate analysis revealed that increasing age and elevated expression of MYC are factors that adversely affect the overall survival; age was an independent prognostic factor for survival. IRS1 and ?-catenin co-localized in the nucleus and cytoplasm of ALL cell lines (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa). In primary cell of normal donor, IRS1 and ?-catenin were found predominantly in the cytoplasm. In Jurkat cells, a constitutive IRS1 and ?-catenin protein interaction was observed and IGF1 stimulation increased IRS1 tyrosine phosphorylation. OSI-906 treatment decreased IGF1R tyrosine phosphorylation, nuclear translocation of ?-catenin and MYC protein expression in Jurkat cells. In conclusion, our data support a link between the signaling pathway IGF1R/IRS1 and activation of ?-catenin in acute lymphoblastic leukemia, which may represent an important axis involved in the pathophysiology of the disease.

A leucemia linfoide aguda (LLA) compreende um grupo heterogêneo de neoplasias caracterizadas por proliferação anormal e acúmulo de células imaturas na medula óssea, o que prejudica a produção de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O fator de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like growth factor 1; IGF1) e seu receptor (IGF1R) regulam o crescimento celular normal e contribuem para a transformação e crescimento de células malignas através da ativação de vias de sinalização intracelular. A via de sinalização do IGF1 é iniciada através da ativação de seu receptor seguido da ativação de seus substratos, incluindo o substrato 1 do receptor de insulina (insulin receptor substrate 1; IRS1). IRS1 é uma proteína predominantemente citosólica envolvida na transdução de sinal, e também desempenha um papel na transformação maligna, sendo altamente expresso em muitos tipos de câncer. Em fibroblastos de camundongos, Irs1, através da sinalização do Igf1, foi descoberto como uma proteína chave para a translocação nuclear da ?-catenina e ativação da transcrição de seus genes alvos, como o Myc e a ciclina D1. MYC e ciclina D1 podem atuar como oncogenes, contribuindo para o desenvolvimento de diversas neoplasias, inclusive as hematopoéticas. Deste modo, o objetivo deste projeto de pesquisa foi investigar a participação do IRS1 nuclear na via da ?-catenina em LLA. Foram utilizadas no estudo linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa) e células hematopoéticas primárias de doadores normais (n=13) e de pacientes adultos com LLA (n=45) atendidos em nossa Instituição. Estudos de expressão gênica (PCRq), expressão, associação proteica (western blotting, imunoprecipitação) e localização celular (fracionamento subcelular e microscopia confocal) foram utilizados. Células da linhagem Jurkat foram submetidas à estimulação com IGF1 e/ou inibição farmacológica de IGF1R (OSI-906). Observamos elevada expressão gênica relativa de IRS1, ?-catenina e MYC nos pacientes com LLA quando comparada aos controles normais (p<0,05), mas não houve diferença na expressão gênica de ciclina D1 e IGF1R entre os dois grupos. Observamos uma correlação positiva entre a expressão gênica de ?-catenina e MYC (p=0.0004; r=0.50), e entre a expressão de IRS1 e MYC (p=0.001; r=0.45) na coorte de pacientes com LLA. Na análise univariada, idade e expressão de MYC correlacionaram-se negativamente com a sobrevida global de pacientes com LLA; idade foi fator independente de prognóstico para a sobrevida. Em linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa), observamos co-localização de IRS1 e ?-catenina no núcleo e no citoplasma. Em células primárias de doador normal, IRS1 e ?-catenina localizaram-se predominantemente no citoplasma. Em células da linhagem celular Jurkat, observamos interação entre IRS1 e ?- catenina e o estímulo com IGF1 provocou o aumento da fosforilação em tirosina de IRS1. O tratamento com OSI-906 diminuiu a fosforilação em tirosina de IGF1R, a translocação nuclear de ?-catenina e a expressão proteica de MYC em células Jurkat. Em conclusão, nossos dados suportam uma relação entre a via de sinalização IGF1R/IRS1 e a ativação da ?- catenina em leucemia linfoide aguda, o que pode representar um importante eixo de sinalização envolvido na fisiopatologia da doença. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of malignancies characterized by abnormal proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow, which impairs the production of erythrocytes, leukocytes and platelets. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) and its receptor (IGF1R) regulate normal cell growth and contribute to transformation and growth of malignant cells through activation of downstream signaling pathways. The IGF1 signaling pathway is initiated through activation of its receptor followed by activation of its substrates, including insulin receptor substrate 1 (IRS1). IRS1 is well known as a cytosolic protein involved in signal transduction, but also plays a role in malignant transformation, being highly expressed in many cancers. In mouse fibroblasts, Irs1, through Igf1 signaling, was found to be the key protein for nuclear translocation of ?-catenin and transcription activation of its target genes, such as Myc and cyclin D1. MYC and cyclin D1 may act as oncogenes, contributing to the development of cancers, including hematopoietic neoplasm. Thus, the aims of this study were to investigate the role of nuclear IRS1 in the ?-catenin pathway in LLA. We used in the study ALL cell lines (Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji) and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=13) and from adult patients with ALL (n=45) treated at our Institution. Studies of gene expression (qPCR), protein expression, association (Western blotting and immunoprecipitation) and cell location (subcellular fractionation and confocal microscopy) were used. Jurkat cells were submitted to IGF1 stimulation and/or IGF1R pharmacological inhibition (OSI-906). IRS1, ?-catenin and MYC relative gene expression were significantly elevated in ALL patients compared to normal controls (p<0.05), but there was no difference in gene expression of cyclin D1 and IGF1R between the two groups. A positive correlation between ?-catenin and MYC relative expression (p=0.0004; r=0.50) and between IRS1 and MYC expression (p=0.001; r=0.45) was found. Univariate analysis revealed that increasing age and elevated expression of MYC are factors that adversely affect the overall survival; age was an independent prognostic factor for survival. IRS1 and ?-catenin co-localized in the nucleus and cytoplasm of ALL cell lines (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa). In primary cell of normal donor, IRS1 and ?-catenin were found predominantly in the cytoplasm. In Jurkat cells, a constitutive IRS1 and ?-catenin protein interaction was observed and IGF1 stimulation increased IRS1 tyrosine phosphorylation. OSI-906 treatment decreased IGF1R tyrosine phosphorylation, nuclear translocation of ?-catenin and MYC protein expression in Jurkat cells. In conclusion, our data support a link between the signaling pathway IGF1R/IRS1 and activation of ?-catenin in acute lymphoblastic leukemia, which may represent an important axis involved in the pathophysiology of the disease.

A Ouabaína (OUA), esteroide cardiotônico endógeno, ao ligar-se a enzima NKA pode sinalizar modulando a atividade da Src quinase e os níveis intracelulares de Ca2+, desencadeando a ativação de diversas vias de sinalização, dentre elas a via do NF&#954;B, que uma vez ativada, é capaz de ativar outras vias de sinalização, como a via canônica da WNT. O objetivo dessa tese foi verificar os efeitos da administração intrahipocampal de OUA, em ratos, na sinalização das vias NF&#954;B, BDNF/CREB e canônica da WNT, assim como os possíveis efeitos morfológicos e funcionais. Os resultados sugerem que a OUA altera o microambiente celular favorecendo a ativação das vias propostas levando ao aumento da arborização dendrítica de neurônios do CA1 e do GD, com melhora da memória de referência espacial dos animais e piora do processo de extinção de memória de longa duração, também conhecido como flexibilidade comportamental, além de proteger os neurônios da apoptose frente a um estímulo excitotóxico. / It is well established that Ouabain (OUA), an endogenous cardiotonic steroid, can bind to NKA and trigger activation of signaling pathways dependent on Src kinase activation and intracellular Ca2+ levels oscillation, what can lead to NF&#954;B activation, and in turn, can transactivate other signaling pathways, such as the canonical WNT pathway. The aim of this thesis was to investigate the effects of intrahippocampal administration of OUA in adult rats, whether it was able to activate NF&#954;B, BDNF/CREB and the canonical WNT signaling pathways, as well as the possible morphological and functional effects of this injection. Results suggested that OUA changed the cellular microenvironment in favor to the activation of the proposed pathways leading to increased dendritic branching in CA1 and DG neurons, with spatial reference memory improvement and worsening of long-term memory extinction. Furthermore, OUA protected neurons from apoptosis stimulus triggered by excitotoxicity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.