Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T04:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249817.pdf: 674568 bytes, checksum: 025894c3794d5b84ab3f99e0d735c6ef (MD5) / Mood disorders are chronic and severe mental disorders. Many compounds, as agmatine, have been investigated regarding their effects and underlying mechanisms in major depression and bipolar disorder. The administration of agmatine, an endogenous cationic amine, elicits an antidepressant-like effect in the mouse forced swimming test (FST) by a mechanism dependent on the inhibition of the NMDA receptors and the L-arginine-nitric oxide (NO) pathway. Since it has been reported that the NO can activate different types of potassium (K+) channels in several tissues, the present study investigated the possibility of synergistic interactions between different types of K+ channel inhibitors and agmatine in the FST. Treatment of mice by i.c.v. route with subeffective doses of tetraethylammonium (a non specific inhibitor of K+ channels, 25 pg/site), glibenclamide (an ATP-sensitive K+ channel inhibitor, 0.5 pg/site), charybdotoxin (a large- and intermediate-conductance calciumactivated K+ channel inhibitor, 25 pg/site) or apamin (a small-conductance calcium-activated K+ channel inhibitor, 10 pg/site), augmented the effect of agmatine (0.001 mg/kg, i.p.) in the FST. Furthermore, the administration of agmatine and the K+ channel inhibitors, alone or in combination, did not affect locomotion in the open-field test. Moreover, the reduction in the immobility time elicited by an active dose of agmatine (10 mg/kg, i.p.) in the FST was prevented by the pretreatment of mice with the K+ channel openers cromakalim (10 ìg/site, i.c.v.) and minoxidil (10 ìg/site, i.c.v.), without affecting locomotion. These results raise the possibility that the antidepressant-like effect of agmatine in the FST is related to its modulatory effects on neuronal excitability, via inhibition of K+ channels. Furthermore, we investigated the effect of agmatine in the ouabain-induced hyperactivity in rats, an animal model of mania. In this study, the pretreatment of the animals with agmatine (0.1, 1 and 10 mg/kg, p.o. administered twice a day for 7 days) was able to attenuate the behavioral and neurochemical changes elicited by acute administration of ouabain, a Na,K-ATPase-inhibiting compound, given by i.c.v. route, in Wistar rats. Ouabain (10 ìM/site) significantly increased motor activity in the open-field test. The pretreatment with lithium chloride (LiCl, 45 mg/kg, p.o.) for seven days completely prevented the hyperactivity, but agmatine (0,1-10 mg/kg) partially prevented the ouabain-induced hyperlocomotion. Ouabain treatment elicited lipid peroxidation (increased TBARS levels) and reduced the glutathione peroxidase (GPx) activity in the hippocampus and glutathione reductase (GR) activity in the cerebral cortex and hippocampus, effects that were completely prevented in rats pretreated with agmatine and LiCl. These results show that agmatine, in a way similar to LiCl, is able to prevent the neurochemical alterations observed in the ouabain-induced model of mania in rats, but was able to reverse only partially the uabain-induced hyperlocomotion. Together, these results suggest that agmatine has not only antidepressant-like effects through an interaction with K+ channels, but also antimanic propierties. Investigar o envolvimeto dos canais de K+ no mecanismo de ação da agmatina no teste do nado forçado e o efeito da agmatina em um modelo animal de mania induzido por ouabaína e sua relação com o estresse oxidativo.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / Bipolar Mood Disorder (BMD) is a chronic and debilitating illness which includes alternate episodes of depression and mania. There is an emerging body of data suggesting that bipolar disorder is associated with impairments in neuroplasticity and cell survival, incluindo DNA damage, changes in brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and Oxidative stress mechanisms. Several studies have found direct and indirect evidence for a mood-state related decrease in the activity of the Na+/K+ATPase. Objective: In this study, we assessed the behavioral and neurochemical parameters in rats submitted to an animal model of mania induced by ouabain (OUA), a specific Na+/K+ATPase inhibitor. Methods: Animals received a single intracerebroventricular (ICV) injection of OUA or artificial cerebrospinal fluid (aCSF), and in different periods at seven days after injection. The behavior was assessed motor activity through the Open Field Test. The data were studied neurochemical markers involved in DNA damage, oxidative stress and the level of BDNF in neuroanatomical structures: hippocampus, amygdala and prefrontal cortex.To investigate predictive validity of the model, the effects of the lithium (Li) and valproate (VPT) were evaluated in BDNF levels and markers of oxidative stress. In the reversal model, animals received a single ICV injection of OUA or aCSF. From the day following the ICV injection, the rats were treated for 6 days with intraperitoneal (IP) injections of saline (SAL), Li or VPT twice a day. In the maintenance treatment (prevention model), the rats received IP injections of Li, VPT, or SAL twice a day for 12 days. In the 7th day of treatment the animals received a single ICV injection of either OUA or aCSF. Finally the effects of BDNF ICV administration on oxidative damage to lipid and protein in the brains of rats submitted to animal model of mania induced by OUA. Results: Our findings demonstrated that OUA induced hyperlocomotion in the openfield test, and this response remained up to 7 days following a single ICV injection. Li and VPT reversed OUA-related hyperactive behavior in both reversal and maintenace model. We observed increased hipocampal and peripheral index of early DNA damage. Showed a significant reduction in BDNF levels in amygdala and hippocampus. Li treatment, but not VPT reversed and prevented the impairment in BDNF expression after OUA administration in these cerebral áreas. OUA induced oxidative stress in prefrontal and hippocampus. Li and VPT treatment reversed and prevented the OUA induced damage, however this effect varies depending on the brain region and treatment regimen. The BDNF was unable to reverse the ouabain-induced hyperactivity. Nevertheless, BDNF treatment protects the OUA-induced damage in the brain of rats. Conclusion: Our results suggest that the present model fulfills adequate face, construct and predictive validity as an animal model of mania, supporting the Na+/K+ATPase hypothesis for BMD. / O Transtorno do Humor Bipolar (THB) é uma doença crônica e debilitante que inclui episódios alternados de depressão e mania. Há um conjunto emergente de dados que sugerem que o THB está associado com alterações na neuroplasticidade e sobrevivência celular, incluindo danos ao DNA, mudanças no fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e mecanismos de estresse oxidativo. Vários estudos encontraram evidências diretas e indiretas para alterações no estado de humor relacionado com a atividade da Na+/K+ATPase no THB. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo avaliar parâmetros comportamentais e neuroquímicos, em ratos submetidos a um modelo animal de mania induzido por ouabaína (OUA), um inibidor específico da Na+/K+ATPase. Métodos: os animais receberam uma única dose intracerebroventricular (ICV) de OUA ou fluido cerebrospinal artificial (aCSF), e foram avaliados em diferentes períodos até sete dias após a injeção. O comportamento avaliado foi a atividade motora, através do teste de campo aberto. Os dados neuroquímicos estudados foram os marcadores envolvidos no dano ao DNA, estresse oxidativo e níveis de BDNF, nas estruturas neuroanatômicas: hipocampo, amígdala e córtex pré-frontal. Para investigar a validade preditiva do modelo, foram avaliados os efeitos do lítio (Li) e valproato (VPT) em níveis BDNF e marcadores de estresse oxidativo. No modelo de reversão, os animais receberam uma injeção única de ICV de OUA ou aCSF. Desde o dia após a injeção ICV, os ratos foram tratados durante 6 dias com injeções intraperitoneal (IP) de solução salina (SAL), Li ou VPT duas vezes por dia. No tratamento de manutenção (modelo de prevenção), os ratos receberam injeções IP de Li, VPT, ou SAL duas vezes ao dia por 12 dias. No sétimo dia de tratamento, os animais receberam uma injeção ICV de OUA ou aCSF. Finalmente, foram avaliados os efeitos da administração ICV de BDNF, sobre o dano oxidativo à lipídios e proteínas, no cérebro de ratos submetidos ao modelo animal de mania. Resultados: Os achados demonstraram que a OUA induziu hiperlocomoção, e esta resposta permaneceu até 7 dias após a sua administração. Li e VPT controlaram o comportamento hiperativo induzido pela OUA em ambos os modelos: reversão e manutenção. Observou-se aumento do índice de dano ao DNA no hipocampo induzido por OUA. Foi demonstrado uma redução significativa nos níveis de BDNF no hipocampo e na amígdala. O uso de Li, mas não VPT, reverteu e impediu a redução da expressão de BDNF após administração de OUA, nessas mesmas estruturas. A OUA induziu a formação do estresse oxidativo nas estruturas córtex pré-frontal e hipocampo. A administração IP de Li e VPT reverteram e impediram o dano induzido por OUA, no entanto, este efeito varia dependendo da região do cérebro e regime de tratamento. O BDNF foi incapaz de reverter a hiperlocomoção induzida pela OUA. No entanto, o tratamento com BDNF protegeu o dano oxidativo induzido por OUA no cérebro de ratos. Conclusão: Os resultados sugerem que o modelo atual apresenta adequada validade de face, construto e valor preditivo como um modelo animal de mania, apoiando a hipótese de disfunção da Na+/K+ATPase no THB.

A administração crônica de ouabaína (OUA) induz hipertensão arterial (HA) em ratos, alterações funcionais e remodelamento em artérias mesentéricas de resistência (AMR). A literatura sugere que a resposta pressórica da OUA pode ser bloqueada pelo antagonismo do receptor AT1 e pela inibição COX-2. No entanto, não se conhece a participação dessas vias no remodelamento arterial nesse modelo de HA. O presente estudo teve como objetivo investigar o papel do sistema renina-angiotensina (SRA) e da COX no remodelamento das AMR induzido pela OUA. Em AMR de ratos OUA, o SRA e a COX-2 participam da resposta pressórica, do remodelamento hipotrófico para dentro e da rigidez. Esses ajustes estão associados ao stress oxidativo e a deposição de colágeno na parede vascular estimulados pela capacidade da OUA em promover a ativação do receptor AT1 e da COX-2. / The chronic administration of ouabain (OUA) induces hypertension in rats, functional and structural alterations in mesenteric resistance arteries (MRA). It is well known that OUA-induced hypertension is blocked by AT1 receptor antagonism and the COX-2 inhibition. However, the participation of these pathways in MRA remodeling in this model of hypertension remains unknown. This study aimed to investigate the role of the renin angiotensin system (RAS) and COX pathways on MRA remodeling induced by OUA. In AMR from OUA rats, RAS and COX-2 participate in the pressor response, the inward hypotrophic remodeling and stiffness. These adjustments are the result of oxidative stressand increasing collagen deposition in the vascular wall stimulated by the OUA ability to stimulate the activation of AT1 receptor and COX-2.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / No transtorno bipolar (TB) ocorre a alternância entre episódios de depressão, mania ou hipomania. O Lítio (Li) é o fármaco mais utilizado como tratamento para o TB. Diversos anticonvulsivantes, como o valproato (VPA), possuem aplicação no tratamento do TB. Estudos mostram que disfunções da Na+K+ ATPase estão envolvidas na fisiopatologia do TB. A administração intracerebroventricular (ICV) ouabaína (OUA) (inibidor da Na+K+ ATPase) em ratos tem sido considerado um bom modelo animal de mania. A glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3) é uma serina/treonina-quinase, geralmente ativa nas células, sendo desativada por sinais originados de vias de sinalização distintas, como a da PI3K/Akt e a da MAPK. Estudos tem demonstrado que Li e VPA inibem diretamente a ação da GSK-3. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ação do Li ou do VPA sobre a via de sinalização de PI3K/Akt/GSK-3 em um modelo animal de mania induzido pela OUA. Foram utilizados ratos Wistar machos adultos. Os animais foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica, em que foi introduzida uma cânula no ventrículo lateral. No primeiro protocolo, os animais receberam injeções ICV de OUA ou de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF). Em seguida foram tratados com Li, VPA ou salina durante sete dias. A avaliação da atividade locomotora foi realizada através do teste do campo aberto, sete dias após a administração de OUA. Foram avaliados os níveis de proteínas de vias da GSK-3 [MAPK, PI3K, AKT e GSK-3β totais e fosforiladas (p)], através das técnicas de Western Blotting. No segundo protocolo, os animais receberam injeções ICV de OUA, de aCSF, de AR-A014418 (inibidor de GSK-3) ou OUA+AR-A014418. Sete dias após, esses animais foram submetidos ao teste do campo aberto. O Li e o VPA reverteram a hiperatividade induzida pela OUA. Adicionalmente, OUA diminuiu a fosforilação de PI3K, de Akt e de GSK-3β. O Li e o VPA reverteram essas disfunções da via de sinalização da GSK-3β induzidas pela OUA. Além disso, AR-A014418 reverteu o comportamento do tipo maníaco induzido por OUA. Esses resultados sugerem que os efeitos do tipo maníaco induzidos pela OUA estão associados com a ativação da GSK-3β (e inibição da PI3K e Akt), e Li e VPA exercem efeitos antimaníacos através da modulação desta via de sinalização. Portanto, sugerem-se mais estudos sobre essa via de sinalização e seu envolvimento no TB.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Bipolar disorder (BD) presents a complex alternating clinical course with recurrent mood switches including manic and depressive episodes making the development of an adequate animal model challenging. Ouabain, a potent Na+K+ATPase inhibitor, intracerebroventricular (i.c.v) administration in preclinical models has been suggested as a model of mania. However, to date, there are no models that mimic mood episodes, mania and depression, in the same animal. The aim of our study was to evaluate manic- and depressive-like behaviors and cognitive, physiological and neurochemical alterations after a single ouabain i.c.v administration in Wistar rats. Moreover, evaluate the effects of the mood stabilizers, lithium (Li) and valproate (VPA), and the antidepressant imipramine (IMI) on behavioral, physiological and neurochemical alterations induced by ouabain. Spontaneous locomotor activity behavior in rats was significantly increased 7 days after ouabain injection compared to control, while Li and VPA reversed this ouabaininduced manic-like behavior. Locomotor activity returned to its basal levels 14 days after ouabain injection. However, 14 days after ouabain injection, was observed depressive-like behavior in the animals, such as increase in the immobility time in the forced-swimming test and decrease in the sucrose consumption. The IMI treatment and the adjunctive treatment of Li or VPA with IMI reversed the depressive-like behavior induced by ouabain. However, Li or VPA, per se, partially reversed these behavioral alterations induced by ouabain. Additionally, depressive-like animals showed cognitive impairment in the inhibitory avoidance task and in the object recognition task. The adrenal gland weight was increased after ouabain administration, which was accompanied by an ACTH serum level increased in the depressive-like animals. Li, VPA or the adjunctive treatment of Li or VPA with IMI were able to reverse the adrenal weigh increased induced by ouabain. The mood stabilizers and the adjunctive treatment of mood stabilizer, Li or VPA plus IMI reversed the ACTH levels increased induced by ouabain. Ouabain decreased the levels of pro-BDNF, BDNF, TrkB and CREB in the brains of rats after i.c.v administration; however this effect varies depending of the experimental protocol and the brain region evaluated. The ouabain administration induced oxidative damage and antioxidant enzymes alterations in the frontal cortex and hippocampus of rats, and Li was able to reverse these impairments. We propose that the ouabain i.c.v administration in preclinical models may be not only a model for manic episodes but also for depressive ones because our results strongly support that ouabain administration leads to a depressive-like phenotype. Another important point is that the proposed model in this study mimics important neurochemical changes, such as oxidative stress and BDNF pathway alterations, which are also seen in bipolar patients. / O transtorno bipolar (TB) é uma condição psiquiátrica complexa, caracterizada por mudanças recorrentes do humor, incluindo episódios maníacos, depressivos e mistos. Este complexo curso clínico faz com que o desenvolvimento de um modelo animal de TB adequado seja um desafio para os pesquisadores da área. Dentre outros modelos, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de ouabaína, um potente inibidor da enzima Na+K+ATPase, em ratos tem sido considerado um bom modelo animal de mania. Entretanto, ainda não existem modelos de experimentação que mimetizam sintomas de ambos os polos do humor, mania e depressão, em um mesmo animal. O objetivo do presente estudo foi avaliar comportamentos tipo-maníaco e tipo-depressivo e alterações cognitivas, neuroquímicas e fisiológicas após a administração i.c.v de ouabaína em ratos Wistar. Além disso, avaliar os efeitos dos estabilizadores do humor, lítio (Li) e valproato (VPA) e do antidepressivo imipramina (IMI) sobre as alterações comportamentais, neuroquímicas e fisiológicas induzidas pela ouabaína. Nossos resultados mostraram que, 7 dias após a administração i.c.v de ouabaína, os animais apresentaram hiperlocomoção no teste do campo aberto e que o tratamento com Li ou VPA reverteu este efeito.Posteriormente, foi demonstrado que 14 dias após a administração i.c.v de ouabaína, não houve alteração locomotora dos animais no teste do campo aberto, porém os animais apresentaram comportamento tipo-depressivo, indicado pelo aumento do tempo imobilidade no teste do nado forçado e diminuição do consumo de sacarose no teste de anedonia. O tratamento com Li, VPA, IMI ou o tratamento combinado IMI com Li ou VPA reverteram as alterações comportamentais tipo-depressivas induzidas pela ouabaína, exceto o tratamento com Li ou VPA que reverteram parcialmente o comportamento tipo-anedônico nos animais. A ouabaína causou dano cognitivo tanto no teste da esquiva inibitória quanto no teste de reconhecimento de objetos, 14 dias após a administração i.c.v de ouabaína. Além disso, houve um aumento do peso da glândula adrenal, bem como um aumento dos níveis de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) no soro destes animais. Li, VPA, IMI ou o tratamento adjunto de Li ou VPA com IMI reverteram a diminuição dos níveis de ACTH induzida pela ouabaína. Enquanto que somente Li, VPA ou o tratamento combinado dos estabilizadores do humor, Li ou VPA, com IMI conseguiram reverter o aumento da glândula adrenal induzida pela ouabaína. A ouabaína diminuiu os níveis de pró-BDNF, BDNF, receptor TrkB e pCREB; entretanto, essas alterações variaram de acordo com o protocolo experimental e com a estrutura cerebral avaliada. A ouabaína, em ambos os protocolos experimentais, aumentou o dano oxidativo, a proteínas e a lipídeos, e alterou a atividade das enzimas antioxidantes no cérebro dos animais. O tratamento com Li reverteu todos os danos oxidativos e as alterações nas enzimas antioxidantes induzidas pela ouabaína. Juntos os resultados do presente estudo indicam que a administração i.c.v de ouabaína em modelos pré-clínicos pode ser não somente um modelo para episódios tipo-maníacos, mas, também para episódios tipo-depressivos, já que a administração de ouabaína induz também o fenótipo tipo-depressivo. Outro ponto importante é que o modelo proposto no presente estudo também mimetiza alterações neuroquímicas importantes, como o estresse oxidativo e alterações na via de BDNF, ambos vistos em pacientes bipolares.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte1.pdf: 1834339 bytes, checksum: 9a90c51efd47d1b0c436c6b761659ab0 (MD5) Previous issue date: 2011-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Initially known as a cardiotonic steroid capable to inhibit the Na+/K+ATPase, ouabain was identified as an endogenous substance present in human plasma, produced by the adrenal, pituitary and hypothalamus and can interfere with various aspects of immune response. In this study, which aimed to study the modulating effect of ouabain on the immune system in vivo and in vitro using mouse models, we demonstrated that treatment for three consecutive days using 0,56 mg/kg ouabain was able to reduce cell migration induced by mitogen Concanavalian A (Con A) to the peritoneum, and this fact reflects a decrease in the number of polymorphonuclear leukocytes, mainly neutrophils. In this same model, ouabain was also able to increase the number of mononuclear leukocytes in the peritoneal cavity. Evaluating the effect of treatment on lymphocytes in peripheral organs, we found that, in lymphocytes from mesenteric lymph nodes, this substance induces a decrease of 20% of T CD3+ lymphocytes, concomitant with an increase in same percentage of B lymphocytes, without, however, modulating the proportion of CD4+ and CD8+ among themselves, as well as the number of regulatory T cells (CD4+/CD25+). In the thymus, the same treatment, does not affect the proportion of lymphocyte subpopulations studied. The analysis qualitative and quantitatively of peripheral blood leukocytes, biometrics and cellularity of spleen, thymus and lymph nodes showed no change in response to ouabain treatment. Comparative studies using treatment for one or two days, with the same dose of 0,56 mg/kg did not trigger modulation, in vivo, in populations of T lymphocytes, B lymphocytes and subpopulations of CD4+ and CD8+ cells in mesenteric lymph nodes. In addition, ouabain was able to inhibit mitochondrial activity of lymphocytes stimulated with Con A, using MTT assay.These findings indicate an immunomodulatory role of ouabain. / Inicialmente, conhecida como um esteróide cardiotônico e por sua propriedade de inibir a Na+/K+ATPase, a ouabaína foi identificada como uma substância endógena presente no plasma humano, produzida pela adrenal, hipófise e hipotálamo e capaz de interferir em vários aspectos da resposta imune. Neste trabalho, que teve como objetivo estudar o efeito modulador da ouabaína no sistema imunológico in vivo e in vitro por meio de modelos murinos, demonstrou-se que o tratamento por três dias consecutivos com ouabaína utilizando a dose de 0,56 mg/kg foi capaz de reduzir a migração celular induzida pelo mitógeno Concanavaliana A (Con A) para o peritôneo, sendo este fato reflexo da redução do número de leucócitos polimorfonucleares, principalmente, neutrófilos. Neste mesmo modelo, a ouabaína também foi capaz de aumentar o número de leucócitos mononucleares no lavado peritoneal. Avaliando-se o efeito desse tratamento no perfil linfocitário de órgãos periféricos, encontrou-se que, em linfócitos de linfonodos mesentéricos, esta substância induz a uma diminuição de 20% de linfócitos T CD3+, concomitante a um aumento de mesmo percentual de linfócitos B, sem, no entanto, modular a proporção de linfócitos TCD4+ e CD8+ entre si, bem como o número de células T regulatórias (CD4+CD25+). No timo, o mesmo tratamento com a ouabaína não interfere na proporção das subpopulações linfocitárias estudadas. As análises qualitativas e quantitativas de leucócitos do sangue periférico, da biometria e celularidade do baço, timo e linfonodos mesentéricos não apresentaram alteração em resposta ao tratamento com a ouabaína. Estudos comparativos utilizando tratamentos de um ou dois dias, com a mesma dose de 0,56 mg/Kg não desencadearam modulação, in vivo, nas populações de linfócitos T, linfócitos B e das subpopulações de linfócitos TCD4+ e CD8+ nos linfonodos mesentéricos. Adicionalmente, a ouabaína foi capaz de inibir a atividade mitocondrial de linfócitos estimulados com Con A, por meio do ensaio de MTT. Estes resultados indicam um papel imunomodulador da ouabaína.

Na,K-ATPase é uma proteína de membrana que tem como função manter o equilíbrio osmótico nas células pela hidrólise de ATP. A ouabaína (OUA) se liga a Na,K-ATPase e é capaz de ativar cascatas de sinalização. As subunidades a da Na,K-ATPase possuem 4 isoformas que são distribuídas de forma diferenciada nos tecidos. As células da glia são importantes na resposta contra lesões no cérebro e também controlam a inflamação. Dados na literatura mostram que a OUA tem efeito protetor em alguns tipos de dano. O objetivo do estudo é avaliar a função da isoforma a2 na cultura de células da glia em resposta à OUA e ao LPS. Nós investigamos a ação da OUA em diversas concentrações e LPS (1g/mL) na viabilidade celular (LDH) e proliferação celular (MTT). O LPS foi utilizado como modelo de inflamação e uma das perguntas era se o tratamento prévio com OUA, seria capaz de reverter a ativação do fator de transcrição NF-kB que está envolvido com inflamação. O pré-tratamento com OUA diminuiu a ativação do NF-kB induzida pelo LPS. Após, nós silenciamos a isoforma a2 das células da glia com RNAi. Os nossos dados mostram que o pré-tratamento com OUA reverte o efeito na ativação do NF-kB causado pelo LPS. Provavelmente, a isoforma a2 está relacionada com alguma via de sinalização que interage com a via do LPS. / Na,K-ATPase is a conserved membrane protein which maintains the osmotic balance in the cell by the hydrolysis of ATP. Ouabain (OUA) binds to Na,K-ATPase and it can activate signaling pathways. The a subunits of Na,K-ATPase have 4 isoforms which are distributed in a different pattern in the tissues. Glial cells have an important role in the response against injury and they also control inflammation. Some data have reported that OUA can protect against some types of injury. The aim of this study is to evaluate the role of a2 isoform in glial cells in response to OUA and LPS stimulus. We investigated the action of OUA and LPS in cell viability (LDH) and cell proliferation (MTT). LPS was used as a model of inflammation and one of our questions was if the treatment with OUA before LPS was capable of reduce the activation of the transcription factor NF-kB which is involved in inflammation. The pre-treatment with OUA decreased the NF-kB activation induced by LPS. We also silenced the a2 isoform in culture glial cells with iRNA. Taken together our data showed that OUA pretreatment reversed the NF-kB activation induced by LPS in primary cultures of glial cells from mice. Probably,the a2 isoform is related with some signaling pathway that interacts with the LPS pathway.

Inibidores da Na+/K+ ATPase, como a ouabaína (OUA), estão associados à gênese/manutenção da hipertensão arterial (HA). Ratos tratados com OUA ficam hipertensos e suas artérias mesentéricas de resistência (AMR) apresentam disfunção vascular, estresse oxidativo e remodelamento estrutural e mecânico. Modelos de HA dependente de volume, como o DOCA-sal, têm aumento da concentração plasmática de OUA. Interagindo com a Na+/K+ ATPase, a OUA ativa vias de proliferação e fibrose, como a via MAPK, ativada quando da fosforilação da c-Src e do EGFR. A rostafuroxina, antagonista da OUA, reduz a pressão arterial (PA) e melhora a disfunção endotelial em AMR de ratos DOCA-sal. Dados do laboratório (não publicados) mostram que a rostafuroxina reverte o remodelamento mecânico e restaura parcialmente o remodelamento estrutural das AMR de ratos DOCA-sal. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos de sinalização celular envolvidos nas mudanças estruturais e mecânicas das AMR de ratos DOCA-sal tratados com rostafuroxina. Ratos Wistar, uninefrectomizados, foram tratados com injeções subcutâneas de DOCA (em mg/kg/semana: 20 na primeira; 12 na segunda e terceira; 6 da quarta ao fim do experimento) e ingeriram água com NaCl (1%) e KCl (0,2%). Cinco semanas após o início do tratamento, um subgrupo passou a ser tratado, concomitantemente, com rostafuroxina (gavagem, 1mg/kg/dia) por 3 semanas. Ao final do protocolo, os animais foram anestesiados, mortos, as AMR dissecadas e fixadas em paraformaldeído (4%) para as análises histológicas ou armazenadas para Western Blot. Análise estatística aplicada: ANOVA uma ou duas vias. Avaliada por meio da plestismografia de cauda, o tratamento com DOCA-sal aumentou a PA; a rostafuroxina reduziu, mas não normalizou a mesma aos valores do grupo SHAM. A razão de colágeno I/III e a expressão proteica dos mediadores fibróticos TGFβ1 e CTGF foi maior nas AMR dos DOCA, alterações restauradas após tratamento com rostafuroxina. Além do mais, houve aumento da espessura da lâmina elástica interna das AMR dos DOCA, o que foi revertido pela rostafuroxina. A expressão de endotelina-1 foi maior nas AMR tanto dos DOCA tratados ou não com rostafuroxina; a expressão do receptor ETΑ foi reduzida nas AMR de ambos os grupos. Já a expressão do receptor ETΒ foi maior nas AMR dos DOCA quando comparados aos SHAM, sendo normalizada pela rostafuroxina. A expressão de c-SrcTyr418 e EGFR, bem como das enzimas c-RAF, ERK 1/2, p-ERK 1/2 e p38MAPK foi maior nas AMR dos DOCA, sendo restauradas com a rostafuroxina. Os dados sugerem que o remodelamento das AMR do grupo DOCA pode ser atribuído à ação direta da OUA sobre a via fibrótica e sobre a elastina, interferindo na rigidez e no diâmetro interno, e também à sua ação indireta, mediada pela endotelina-1 que, agindo em receptores ETB e transativando o EGFR, ativa a via da MAPK, a qual está associada aos eventos de proliferação e fibrose celular. / Na+/K+ ATPase inhibitors, such as ouabain (OUA), are associated with genesis/maintenance of hypertension. Rats treated with OUA are hypertensive and their mesenteric resistance arteries (MRA) exhibit vascular dysfunction, oxidative stress and structural and mechanical remodeling. Volume-dependent hypertensive models, as DOCA-salt, have increased plasmatic OUA levels. Interacting with Na+/K+ ATPase, OUA activates proliferation and fibrosis pathways, such as MAPK pathway, which is activated from c-Src and EGFR phosphorylation. Rostafuroxin, an OUA antagonist, reduces arterial pressure (AP) and improves endothelial dysfunction in MRA of DOCA-salt rats. Unpublished data of our laboratory have shown that rostafuroxin reverses the mechanical and partially restores the structural remodeling of MRA of DOCA-salt rats. Thus, the aim of this study was to evaluate the cellular signaling mechanisms involved in the structural and mechanical changes in MRA of DOCA-salt rats treated with rostafuroxin. Male Wistar rats, uninephrectomized, were treated with subcutaneous injections of DOCA (mg/kg/week: 20 in the 1st; 12 in the 2nd and 3rd; 6 from 4th to the end of the experiment) and drunk water with NaCl (1%) and KCl (0,2%). After 5 weeks of treatment, a subgroup started being treated, concomitantly, with rostafuroxin (gavage, 1mg/kg/day) for 3 weeks. At the end of the protocol, animals were anesthetized, killed, the MRA dissected out and fixed in paraformaldehyde (4%) to histological analyses or stored to Western Blot. Statistical analysis applied: ANOVA one- or two-way. Evaluated by pletismography, the DOCA-salt treatment raised the AP levels; rostafuroxin reduced it, but did not normalized to the values of SHAM group. Collagen I/III ratio and protein expression of fibrosis mediators TGFβ1 and CTGF was higher in MRA of DOCA and rostafuroxin restored these parameters. In addition, an increment in the thickness of inner elastic lamina was observed in MRA of DOCA, which was reversed by rostafuroxin treatment. Endothelin-1 expression was higher in MRA of both DOCA and rostafuroxin treated rats; ETΑ receptor was less expressed in both groups. On the other hand, ETΒ was more expressed in MRA from DOCA and normalized to SHAM levels by rostafuroxin treatment. The expression of c-SrcTyr418 and EGFR, as well as of the enzymes c-RAF, ERK 1/2, p-ERK 1/2 and p38MAPK was higher in MRA of DOCA when compared to SHAM, being restores with rostafuroxin. Taken together, the present data suggest that MRA remodeling in DOCA group can be attributed to direct action of OUA on elastin and fibrotic pathway, interfering in stiffness and inner diameter, as well as to its indirect action, mediated by endothelin-1, which acting in ETB receptors and activating EGFR, activates MAPK pathway, which is associated to proliferation and fibroses events.

A ouabaína (OUA), um inibidor da Na+ ,K+-ATPase, foi identificada como uma substância endógena presente no plasma humano, e parece estar envolvida na resposta ao estresse agudo, em animais e seres humanos. O estresse crônico é um importante fator agravante de doenças psiquiátricas, incluindo depressão e ansiedade. Além disso, problemas cognitivos são cada vez mais reconhecidos como importantes componentes da ansiedade e depressão. Diante disto, o presente trabalho buscou investigar os efeitos da OUA (1,8 <font face = \"symbol\">mg/kg) na hiperatividade do eixo HPA, na neuroinflamação, na expressão de receptores e proteínas envolvidos na plasticidade sináptica, nos efeitos comportamentais (como déficit de memória de longa duração, depressão e ansiedade) e atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo protocolo de estresse crônico imprevisível (CUS) realizado ao longo de 14 dias em ratos. Nossos resultados demonstraram que o tratamento intermitente com OUA é capaz de reverter a hiperatividade do eixo HPA induzido pelo CUS, por meio da redução de glicocorticoide, redução na expressão de CRH-CRHR1, bem como diminuir a neuroinflamação, e aumentar os níveis de BDNF e fazer o que na expressão dos receptores CRHR2. Essas alterações bioquímicas contribuíram para uma reversão nos prejuízos na memória de longo prazo induzida pelo CUS. Ademais os animais tratados apenas com OUA, bem como os submetidos ao CUS e tratados com OUA obtiveram uma melhora na memória emocional, averiguada no teste comportamental de condicionamento da memória ao medo. Os resultados encontrados sugerem que o protocolo de CUS por 14 dias promove uma adaptação neuronal facilitando a redesignação da memória ao medo, aqui configurado pelo choque, e o tratamento com a OUA abrevia esse processo. Em conclusão os nossos resultados sugerem que o tratamento intermitente com OUA suscita uma adaptação no eixo HPA, por meio de alterações na expressão dos receptores para CRH no hipocampo e hipotálamo, resultando em uma adaptação na memória emocional relacionada ao medo. / Ouabain (OUA), an inhibitor of Na+, K+ -ATPase, has been identified as an endogenous substance present in human plasma, and appears to be involved in the response to acute stress in animals and humans. Chronic stress is an important aggravating factor of psychiatric illness, including depression and anxiety. In addition, cognitive problems are increasingly recognized as important components of anxiety and depression. The present work aimed to investigate the effects of OUA (1.8 <font face = \"symbol\">mg/kg) on HPA axis hyperactivity, neuroinflammation, expression of receptors and proteins involved in synaptic plasticity, behavioral effects (such as long-term memory deficit duration, depression and anxiety) and Na+,K+-ATPase activity induced by the unpredictable chronic stress protocol (CUS) performed over 14 days in rats. Our results demonstrated that intermittent treatment with OUA was able of reversing CUS-induced HPA axis hyperactivity, by reducing glucocorticoid levels, CRH-CRHR1 expression, as well as reducing CUS-induced low-grade neuroinflammation, and increase BDNF levels and expression of CRHR2 receptors. These biochemical changes contributed to a reversal in CUS-induced long-term memory impairment. In addition, animals treated only with OUA, as well as those submitted to CUS, and also treated with OUA obtained an improvement in emotional memory, which was explored in the fear conditioning test. These results suggest that the CUS protocol of 14 days promotes a neural adaptation facilitating a reassignment of the memory to the fear, here configured by the shock, and the treatment with the OUA shortens that process. In conclusion, our results suggest that intermittent treatment with OUA induces an adaptation on the HPA axis, through alterations in the expression of receptors for CRH in the hippocampus and hypothalamus, resulting in an adjustment in fear-related emotional memory.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5574506 bytes, checksum: a2d785f5339e8cb5e573693458ab5abd (MD5) Previous issue date: 2011-09-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Ouabain, known as a cardiotonic glycoside capable of inhibiting the Na+/K+ ATPase, was widely used for heart failure treatment. Identified as an endogenous substance, ouabain is capable of interfering with various physiological functions, including immune system modulation. Besides that, little is known about the involvement of this substance in nociceptive and inflammatory processes. The present study investigated the role of ouabain in acute peripheral inflammation induced by intraplantar administrartion of different phlogistic agents (carrageenan, compound 48/80, histamine, bradykinin, and PGE2) and in nociceptive processes (abdominal writhing induced by acetic acid and hot plate). Ouabain produced a significant reduction in the mouse paw edema induced by carrageenan and compound 48/80. This antiinflammatory effect of ouabain is associated to the inhibition of PGE2, bradykinin, and mast-cell degranulation, but not to histamine. Ouabain also presented a central and peripheral anti-nociceptive activity. This analgesic potential might be related to the inhibition of inflammatory mediators and to activation of opioid receptors, since it was reversed by naloxone, an opioid antagonist. Additionally, the analgesic effect of ouabain was not related to sedative effect or to motor function. Taken together, the present work demonstrated for the first time, in vivo, the antiinflammatory and analgesic potential of ouabain / A Ouabaína é um glicosídeo cardiotônico, inibidor da Na+/K+-ATPase, utilizada na clínica para o tratamento de insuficiência cardíaca. Atualmente, sabe-se que essa substância é endógena, e capaz de interferir em várias funções fisiológicas, inclusive em diversos aspectos do sistema imunológico. Apesar disso, pouco se sabe sobre seu envolvimento em processos inflamatórios e nociceptivos. Neste trabalho, foi avaliada a atividade da Ouabaína na inflamação aguda desencadeada pela administração de diversos agentes flogísticos (carragenina, composto 48/80, histamina, PGE2 e bradicinina) e em modelos nociceptivos (contorções abdominais induzidas por ácido acético e placa quente). A Ouabaína produziu uma redução no edema de pata produzido por carragenina e pelo composto 48/80. Esse potencial anti-inflamatório está relacionado ao bloqueio da degranulação de mastócitos, bem como pela inibição da via da PGE2 e da bradicinina, porém é independente da via da histamina. A Ouabaína também apresentou uma atividade anti-nociceptiva central e periférica. Esse efeito está vinculado à inibição da via dos mediadores inflamatórios e a mecanismos opióides, visto que foi revertido pela administração da naloxona, um inibidor dos receptores opióides. Adicionalmente, foi descrito que a inibição da dor pela Ouabaína não possui envolvimento com sedação ou diminuição da capacidade motora. O conjunto desses dados demonstra pela primeira vez, in vivo, a atividade anti-inflamatória e anti-nociceptiva da Ouabaína.