Abstract Endocrine disorders are common in adults with epilepsy on antiepileptic drugs (AEDs). This study aimed to evaluate endocrine function, lipid metabolism and growth in patients with childhood- or adolescence-onset epilepsy. Altogether 148 patients with epilepsy on carbamazepine (CBZ), oxcarbazepine (OXC), valproate (VPA) or lamotrigine monotherapy during pubertal maturation and 124 healthy controls participated in this population-based cohort study. Boys and young men (n = 140) underwent cross-sectional evaluation once, and girls and young women (n = 132) twice at an approximate interval of 6 years. Gonadal structure and serum reproductive and thyroid hormone and lipid concentrations were evaluated and growth data were gathered. Elevated serum testosterone and androstenedione levels and polycystic ovary syndrome (PCOS) were common in female subjects whose medication, especially VPA, continued into young adulthood. Serum reproductive hormone concentrations and ovarian structure were similar in patients off medication and controls in young adulthood. CBZ was associated with elevated serum sex hormone binding globulin and decreased dehydroepiandrosterone sulfate levels and VPA with elevated serum androstenedione concentrations in male patients. Testicular structure was similar in patients and controls. CBZ, OXC and VPA were associated with changes in serum thyroid hormone, thyrotropin and lipid levels during pubertal maturation in female patients, but these levels returned to normal after withdrawal of medication. Linear growth and final height were normal in female patients, but overweight was common if they had been obese and on VPA medication during pubertal maturation. Elevated serum androgen levels, PCOS and overweight are common if epilepsy and AED use, especially VPA, continue into young adulthood. These untoward changes or alterations in serum thyroid hormone or lipid concentrations are not present in young women with medication withdrawn. CBZ and VPA are associated with changes in serum sex hormone levels in boys and young men with epilepsy. Epilepsy and AED use during pubertal maturation does not seem to affect growth.

Orientador: Sebastião Roberto Taboga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T17:58:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scarano_WellersonRodrigo_D.pdf: 4897591 bytes, checksum: ce5fe2f21b6836d646532424d518315c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O tecido prostático é susceptível aos desníveis hormonais provocados, principalmente pelo processo de envelhecimento. A hiperplasia benigna prostática e o câncer de próstata são doenças que acometem uma grande parcela da população masculina, e parecem estar envolvidas com alterações hormonais. Por isso, o esclarecimento dos processos celulares e teciduais envolvendo os hormônios sexuais: testosterona e estradiol são, sem dúvida, importantes para o entendimento da etiologia desses processos patológicos. O gerbilo (Meriones unguiculatus) foi utilizado como modelo experimental pois, segundo a literatura, é susceptível ao aparecimento de lesões autóctones e responde bem à carcinogênese experimental, mostrando-se um bom modelo experimental. Numa primeira etapa, foram utilizados animais de três idades diferentes: púbere, adulta e senil. Esses animais foram submetidos à suplementação androgênica e as próstatas ventrais foram destinadas a análises histopatológicas, quantitativas, imunocitoquímicas e ultraestruturais. Foi observado aumento no peso da glândula e também na altura das células epiteliais em todas as idades. Tal aumento reflete o aumento da capacidade sintética observada pela dilatação das organelas de síntese, às vezes de aspecto vesiculoso, ocupando toda a região supranuclear. Nos animais adultos e velhos foram notadas regiões hiperplásicas e displásicas freqüentemente associadas a Neoplasias Intraepiteliais de diferentes graus e a adenocarcinomas. Houve aumento na espessura da camada de células musculares lisas (CML) ao redor dos ácinos nos animais púberes e adultos, enquanto nos animais velhos houve diminuição dessa camada. Além disso, as CML se mostraram aparentemente hipertróficas e com maior atividade sintética nos animais púberes e adultos. Foi notado aparente aumento da vascularização periacinar, onde se observou a presença de freqüentes vasos sanguíneos em todas as idades após o tratamento. Ademais, em todas as idades foi observado aumento da densidade de marcação de receptores androgênicos após o tratamento, evidenciando a possível relação desses receptores com os efeitos observados. Em uma segunda etapa experimental, avaliou-se o efeito do estradiol sobre o tecido prostático intacto e hipoandrogênico em animais adultos, tentando com isso simular situações de descompensação hormonal, típicas da senilidade. As alterações epiteliais foram freqüentes nos animais tratados com estradiol onde se observou aumento na altura das células epiteliais, aparecimento de regiões de intensa displasia e hiperplasia, e a formação de PINs. Outro aspecto que independe da presença da testosterona é o arranjo dos elementos fibrilares e não fibrilares da matriz extracelular entre as CML, apontando para um possível papel dessas células no rearranjo e na síntese desses componentes após os tratamentos estrogênicos. Nos animais castrados observou-se acúmulo de elementos da matriz extracelular sob o epitélio e em animais intactos presença desses elementos dispersos e escassos. Em ambos os grupos: intactos e castrados, notou-se que as CML e os fibroblastos apresentam fenótipo secretor acentuado após o tratamento com estradiol. Houve aumento na densidade de marcação ERa e AR positivos em regiões de hiperplasia apontando para um possível papel desses receptores na formação de lesões pré-malígnas e malignas. Portando, conclui-se que o gerbilo é susceptível a ação da testosterona e do estradiol, os quais provocam desarranjos estruturais e ultraestruturais de cunho patológico e funcional, mostrando-se um ótimo modelo para o estudo das doenças prostáticas de etiologia hormonal / Abstract: Not informed. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20613号 / 医博第4262号 / 新制||医||1023(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小川 修, 教授 篠原 隆司, 教授 近藤 玄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Diversos genes expressos durante a diferenciação das células germinativas atuam no desenvolvimento ovariano. A diferenciação das células somáticas ovarianas depende do número de células germinativas pré-meióticas que migram para a fenda gonadal. A expressão espaço-temporal de genes envolvidos na diferenciação dessas células e a posterior sobrevivência dos oócitos meióticos são de interesse no estudo dos distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XX. Entre os genes envolvidos nesses processos estão o NANOS3, BMP15 e STRA8. O NANOS3, uma molécula de ligação ao RNA que bloqueia a via apoptótica, assegura a sobrevivência das células germinativas durante sua migração para o interior da gônada. O STRA8 atua no início da meiose das células germinativas na gônada de embriões XX, sendo o primeiro sinal de dimorfismo gonadal. Por outro lado a subseqüente sobrevivência dos oócitos é controlada por fatores de transformação e crescimento como o BMP15, que promove a diferenciação das células da granulosa que por sua vez participam indiretamente da diferenciação dos oócitos e das células da teca. Neste trabalho pesquisamos a presença de mutações inativadoras nos genes NANOS3 e BMP15 em 45 pacientes com disgenesia gonadal (DG) 46,XX (10 casos familiais) e 40 pacientes com amenorréia secundária sem mutação nos genes FSHR e SF1. Também pesquisamos mutações nas regiões promotora proximal e codificadora do gene STRA8 de 45 pacientes com DG 46,XX, 16 pacientes com DDS ovotesticular 46,XX e 5 pacientes com DDS testicular 46,XX todos SRY negativo nos quais foram afastados defeitos moleculares nos genes DAX1, WNT4 e SOX9. No NANOS3 identificamos a mutação p.E120K em homozigose, a primeira associada ao fenótipo de DG 46,XX. Esta mutação missense foi identificada em duas irmãs com DG 46, XX e está localizada no domínio de ligação do tipo dedo de zinco da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No BMP15, uma nova mutação nonsense p.Q115X foi identificada em homozigose em duas irmãs com DG 46XX e em heterozigose em uma paciente com amenorréia secundária não familial. O códon de parada prematuro está localizado na região do pré-peptídeo da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No gene STRA8, um único polimorfismo previamente descrito na literatura (rs7805859) foi identificado na região codificadora e nenhuma alteração na região promotora proximal foi identificada. Em conclusão, identificamos pela primeira vez uma mutação no gene NANOS3 associado á DG 46,XX e confirmamos a participação do BMP15 neste fenótipo. Distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XX podem ser causados por mutações em genes envolvidos tanto na diferenciação quanto manutenção das células germinativas ovarianas. / Several genes expressing during the germ cell differentiation act in ovary development. The differentiation of somatic ovary cells depends of a pool of pre meiotic germ cells migration into the gonad. The space and temporal expression pattern of some genes involved with germ cell differentiation and the subsequently oocyte survival should be investigated in the disorders of sexual development (DSD) 46,XX. Some key genes involved with these processes are: NANOS3, BMP15 and STRA8. The NANOS3, a RNA binding molecule that blocks the apoptotic pathway, ensures the survival during migration into genital ridge. The STRA8 acts in the bigining of germ cells meioses in XX embryos and mark the first sexual gonadal dimorphism. In other hand the subsequently oocyte survival is controlled through transforming growth factor member BMP15, that guarantees granulose cells differentiation that acts indirectly in meiotic oocyte and theca cells differentiation. In this work we searched for the presence of inactivating mutations in NANOS3 and BMP15 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis (10 familial cases) and 40 patients with secondary amenorrhea without FSHR and SF1 mutation. We also searched for inactivating mutations in coding and proximal promoter region of STRA8 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis, 16 ovotesticular disorder of sex development (DSD) patients and five 46XX testicular DSD patients all SRY negative and molecular defects in DAX1, WNT4 and SOX9 gene. In NANOS3 we identified the mutation p.E120K in homozygous state, the first associated with DG 46,XX phenotype. This missense mutation was identified in two sisters with 46XX GD and affects a zinc finger domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In BMP15, a new nonsense mutation p.Q115X was identified two sisters in homozygous state and in one sporadic case of secondary amenorrhea in heterozygous state. The premature codon STOP affects the pro-peptide domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In STRA8, only a previously described polymorphism (rs7805859) was identified without any other variation in coding or proximal promoter region. In conclusion, we identified for the fist time mutation in NANOS3 associated with DG 46XX and corroborate the role of BMP15 in this phenotype. Disorders of gonadal development 46,XX may be involved with differentiation and maintenance of ovarian germ cells.

Introdução: Várias evidências em estudos de animais knockout sugerem a efetiva participação dos genes Fgf9-Fgfr2 no processo de determinação testicular. Animais XY knockout para os genes Fgf9 e Fgfr2 apresentam reversão sexual como consequência da alteração na cascata de eventos masculinizantes nas gônadas fetais. Até o momento, mutações inativadoras dos genes FGF9-FGFR2 não foram descritas em pacientes 46, XY portadores de disgenesia gonadal. Objetivos: Pesquisar a presença de mutações inativadoras nos genes FGF9 e FGFR2 em pacientes portadores de DDS 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal. Casuística e Métodos: Trinta e três pacientes com disgenesia gonadal 46, XY, 11 com a forma completa e 22 com a forma parcial. As regiões codificadoras dos genes FGF9 e FGFR2 de todos os pacientes foram amplificadas e sequenciadas. As investigações quanto a presença de deleções foram realizadas usando-se a técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification). Resultados: Mutações ou deleções nos genes FGF9 não foram encontradas em nenhum dos pacientes estudados, apenas alguns polimorfismos previamente descritos. No gene FGFR2 não foram encontradas deleções. Uma nova variante não sinônima em heterozigose, c.1358 C>T (p.Ser453Leu), localizada no exon 10 do FGFR2 foi encontrada em duas irmãs com disgenesia gonadal parcial 46,XY. A mãe é portadora da variante alélica e o estudo de 147 indivíduos controles não identificou a presença desta variante. A análise da variante em sites de previsão, PolyPhen, SIFT e Mutation Taster indicou que a nova proteína FGFR2 é possivelmente danificada. Conclusões: Se esses resultados dos sites de previsão forem confirmados em estudos funcionais futuros a participação do gene FGFR2 na determinação gonadal masculina em humanos estará comprovada / Introduction: Several evidence in animal studies \"knockout\" suggest the effective participation of Fgf9-Fgfr2 genes in testicular determination process. Animals XY \"knockout\" for Fgf9 and Fgfr2 genes exhibit sex reversal as a result of the change in the cascade of masculinizing events in fetal gonads. To date, So far inactivating mutations of FGF9 and FGFR2 genes have not been described in 46,XY patients with gonadal dysgenesis. Objectives: To investigate the presence of inactivating mutations in the FGF9 and FGFR2 gene in patients with 46,XY DSD by gonadal abnormalities. Casuistic and Methods: Thirty-three patients with 46,XY gonadal dysgenesis, 11 with the full form and 22 with the partial form. The coding regions of FGF9 and FGFR2 genes of all patients were amplified and sequenced. Investigations on the presence of deletions were made using the MLPA technique (\"Multiplex ligation-dependent probe amplification\"). Results: Mutations or deletions in the FGF9 gene were not found in any of the patients studied, only a few polymorphisms previously described. FGFR2 gene deletions were not found. A new non-synonymous variant in heterozygosis, c.1358 C> T (p.Ser453Leu) located in exon 10 of FGFR2 was found in two sisters with 46,XY partial gonadal dysgenesis. The mother is a carrier of the variant allele and the study of 147 control subjects did not identify the presence of this variant. The analysis of the variant on prediction sites, \"PolyPhen\", \"SIFT\" and \"Mutation Taster\" indicated that the new FGFR2 protein is possibly damaged. Conclusions: If the results of the prediction sites are confirmed by future functional studies the participation of the FGFR2 gene in human male gonadal determination will be proven

Os distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal são doenças genéticas heterogêneas. Os testes genéticos que utilizam o sequenciamento de genes candidatos pelo método de Sanger é efetivo para o diagnóstico etiológico em menos de 40% desses pacientes. O sequenciamento de nova geração é uma ferramenta eficaz no diagnóstico de pacientes com DDSs. No presente estudo, utilizamos o sequenciamento exômico paralelo em larga escala (SEPLE) para identificar variantes alélicas potencialmente causadoras dos DDSs. Pacientes com síndrome de regressão testicular embrionária (SRTE) familial, membros de duas famílias brasileiras não relacionadas (família 1: dois irmãos afetados e pais não afetados e família 2: indivíduo índice, irmã não afetada e sobrinho afetado, filho da irmã do índice) foram selecionados inicialmente. Estes pacientes apresentavam micropenis, testículos ausentes ou disgenéticos e ausência de útero. O DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico e o SEPLE foi realizado usando a plataforma Illumina-HiSeq-2500. Uma nova variante em heterozigose, c.923C > T, (p.Arg308Gln), no DHX37 foi identificada em todos os membros afetados das duas famílias brasileiras. O sequenciamento por Sanger confirmou a presença da variante em todos os afetados, no pai não afetado da F1 e na mãe não afetada do F2. A presença de efeito fundador da variante nestas duas famílias foi excluído, através da análise de 29 marcadores localizados no cromossomo 12q. Trinta e cinco pacientes com 46, XY DDS por anormalidades do desenvolvimento gonadal (6 com SRTE e 29 com disgenesia gonadal) esporádicos foram incluídos na pesquisa de variantes no DHX37 por Sanger ou por painel de genes candidatos (Plataforma Illumina-HiSeq-2500). As variantes c.923C > T, (p.Arg308Gln) em heterozigose e a variante c.451G > A, (p.Arg151Trp) em homozigose foram identificadas no DHX37 em dois pacientes com SRTE esporádicos. As variantes c.142C > T (p.Ala48Thr) e c.2020G > A (p.Arg674Trp) foram identificadas em heterozigose em dois pacientes esporádicos com disgenesia gonadal (DG). De acordo com o American College of Medical Genetics e Genomics guideline (ACMG), as variantes foram classificadas como provavelmente patogênicas (p.Arg308Gln e p.Arg674Trp), variante de significância clínica incerta (p.Arg151Trp) e variante benigna (p.Ala48Thr). Três variantes identificadas no DHX37 eram causadoras de doença em mais de três das ferramentas de previsão in silico utilizadas. Nenhuma das novas variantes no DHX37 foi encontrada nas bases de dados da população disponíveis (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD e abraOM) com uma frequência maior do que 0,01%. O padrão de metilação da região promotora do DHX37 dos membros afetados e não afetados das famílias 1 e 2 e controles femininos e masculino foi analisado utilizando o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). Um sítio CpG hipometilado na região promotora do DHX37 foi observado apenas no pai da F1 quando comparado com as amostras dos filhos afetados, membros da F2 e controles. A análise imuno-histoquímica do padrão de expressão da proteína DHX37 foi realizada em amostras de testículos de oito indivíduos com diferentes idades cronológicas. Esta analise revelou que no tecido testicular de recém-nascidos, indivíduos em idade puberal e adultos, o DHX37 estava expresso em células germinativas em diferentes estágios de maturação (presentes nas espermatogonias, espermatócitos e espermátides e ausente nos espermatozoides). Este achado sugere que a proteína DHX37 pode ter um papel no processo de desenvolvimento das células germinativas. O DHX37 (12q24.31) codifica uma proteína DEAH (Asp-Glu-Ala-His) que pertence às famílias RNA helicases cujos membros estão envolvidos em quase todos os processos relacionados ao RNA, bem como ao controle do crescimento, proliferação e processos de diferenciação celular. Pacientes descritos com deleções na região 12q24.31, que contém o DHX37, apresentavam características sindrômicas e anormalidades genitais, como hipospadias ou micropenis. A presença de anormalidades genitais nestes pacientes reforça a hipótese de que o DHX37 está envolvido na etiologia dos DDSs 46,XY. Em conclusão, identificamos fortes evidências de um novo gene, o DHX37, envolvido no processo de desenvolvimento e manutenção das gônadas masculinas. Estudos complementares serão necessários para esclarecer o papel exato do DHX37 nas redes reguladoras de genes que controlam o desenvolvimento sexual humano / 46,XY disorders of sex development (DSD) associated with abnormalities of gonadal development are heterogeneous genetic diseases. Genetics testing using Sanger sequencing of candidate genes is effective for diagnosis in less than 40% of these patients. Next-generation sequencing has been a powerful genetic diagnostic tool in the investigation of DSD patients. In the present study, we used the whole exome sequencing (WES) to identify potentially DSD-causing allelic variants. Patients with familial embryonic testicular regression syndrome (ETRS) of two non-related Brazilian families (Family 1 (F1)- two affected brothers and the unaffected parents; Family 2 (F2)- index patient, his unaffected sister and an affected nephew, the son of the index\'s sister) were initially selected. The patients had micropenis, absent or dysgenetic testes and no uterus. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes and WES was performed using the Illumina-HiSeq-2500 platform. A novel heterozygous variant, c.923C > T, (p.Arg308Gln), in the DHX37 gene was identified in all affected members of the two Brazilian families and in F1\'s father. Sanger sequencing confirmed the presence of the variant in the all of the affected members and in F1\'s father and in F2\'s mother. The presence of a founder effect in these families was investigated using 29 markers located on chromosome 12q and was ruled out. Thirty-five additional patients with sporadic 46,XY DSD associated with abnormalities of gonadal development (6 with ETRS and 29 with gonadal dysgenesis) were screened for variants in this novel candidate gene using Sanger or NGS-based targeted sequencing panel of DSD candidate genes (Illumina-HiSeq-2500 platform). The heterozygous variant c.923C > T (p.Arg308Gln) and the homozygous variant c.451G>A, (p.Arg151Trp) in the DHX37 were identified in two sporadic SRTE patients. The heterozygous variants c.142C > T (p.Ala48Thr) and c.2020G > A (p.Arg674Trp) were identified in two sporadic 46,XY gonadal dysgenesis (GD) patients. According to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines (ACMG) the variants were classified as likely pathogenic (p.Arg308Gln, p.Arg674Trp), variant of uncertain clinical significance (p.Arg151Trp and) and benign variant (p.Ala48Thr); and all three of them were disease causing in more than three of the in silico prediction tools used. None of the novel DHX37 variants identified were found in the available population databases (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD and abraOM) in more than 0.01%. Segregation analysis of DHX37 allelic variants was performed in 5 families and resulted in the autosomal dominant with incomplete penetrance and recessive inheritance patterns. DNA methylation pattern of the DHX37 promotor region of F1 and F2\'s affected and unaffected members and gender-matched controls was analyzed using the Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). One hypomethylated CpG site in the promoter region of the DHX37 was only observed in F1\'s father compared with the affected siblings, F2\'s members and controls. Immunohistochemical analysis of DHX37 protein expression pattern was performed on testis samples of eight individuals with different chronological ages. This analysis revealed that in the testicular tissue of newborns, pubertal and adults, the DHX37 was expressed in different stages of germ cells maturation (present in spermatogonia, spermatocytes and spermatids and absent in spermatozoa). This finding suggests that DHX37 protein might have a role in the process of germ-cells development. The DHX37 (12q24.31) encodes a DEAH (AspGlu- Ala-His) protein of the RNA helicase families, whose members are involved in almost all RNA-related process such as the control of cell growth, proliferation and differentiation processes. Previously described patients with 12q 24.31 deletions, which contains DHX37, showed syndromic features and genital abnormalities as hypospadias or micropenis. This phenotype reinforces the hypothesis that DHX37 is involved in the etiology of disorders in male sex development. In conclusion, a novel gene, the DHX37, involved in the process of development and maintenance of male gonads was identified. Further studies will be necessary to clarify the exact role of the DHX37 in the gene regulatory networks controlling human sex development

Diversos genes expressos durante a diferenciação das células germinativas atuam no desenvolvimento ovariano. A diferenciação das células somáticas ovarianas depende do número de células germinativas pré-meióticas que migram para a fenda gonadal. A expressão espaço-temporal de genes envolvidos na diferenciação dessas células e a posterior sobrevivência dos oócitos meióticos são de interesse no estudo dos distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XX. Entre os genes envolvidos nesses processos estão o NANOS3, BMP15 e STRA8. O NANOS3, uma molécula de ligação ao RNA que bloqueia a via apoptótica, assegura a sobrevivência das células germinativas durante sua migração para o interior da gônada. O STRA8 atua no início da meiose das células germinativas na gônada de embriões XX, sendo o primeiro sinal de dimorfismo gonadal. Por outro lado a subseqüente sobrevivência dos oócitos é controlada por fatores de transformação e crescimento como o BMP15, que promove a diferenciação das células da granulosa que por sua vez participam indiretamente da diferenciação dos oócitos e das células da teca. Neste trabalho pesquisamos a presença de mutações inativadoras nos genes NANOS3 e BMP15 em 45 pacientes com disgenesia gonadal (DG) 46,XX (10 casos familiais) e 40 pacientes com amenorréia secundária sem mutação nos genes FSHR e SF1. Também pesquisamos mutações nas regiões promotora proximal e codificadora do gene STRA8 de 45 pacientes com DG 46,XX, 16 pacientes com DDS ovotesticular 46,XX e 5 pacientes com DDS testicular 46,XX todos SRY negativo nos quais foram afastados defeitos moleculares nos genes DAX1, WNT4 e SOX9. No NANOS3 identificamos a mutação p.E120K em homozigose, a primeira associada ao fenótipo de DG 46,XX. Esta mutação missense foi identificada em duas irmãs com DG 46, XX e está localizada no domínio de ligação do tipo dedo de zinco da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No BMP15, uma nova mutação nonsense p.Q115X foi identificada em homozigose em duas irmãs com DG 46XX e em heterozigose em uma paciente com amenorréia secundária não familial. O códon de parada prematuro está localizado na região do pré-peptídeo da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No gene STRA8, um único polimorfismo previamente descrito na literatura (rs7805859) foi identificado na região codificadora e nenhuma alteração na região promotora proximal foi identificada. Em conclusão, identificamos pela primeira vez uma mutação no gene NANOS3 associado á DG 46,XX e confirmamos a participação do BMP15 neste fenótipo. Distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XX podem ser causados por mutações em genes envolvidos tanto na diferenciação quanto manutenção das células germinativas ovarianas. / Several genes expressing during the germ cell differentiation act in ovary development. The differentiation of somatic ovary cells depends of a pool of pre meiotic germ cells migration into the gonad. The space and temporal expression pattern of some genes involved with germ cell differentiation and the subsequently oocyte survival should be investigated in the disorders of sexual development (DSD) 46,XX. Some key genes involved with these processes are: NANOS3, BMP15 and STRA8. The NANOS3, a RNA binding molecule that blocks the apoptotic pathway, ensures the survival during migration into genital ridge. The STRA8 acts in the bigining of germ cells meioses in XX embryos and mark the first sexual gonadal dimorphism. In other hand the subsequently oocyte survival is controlled through transforming growth factor member BMP15, that guarantees granulose cells differentiation that acts indirectly in meiotic oocyte and theca cells differentiation. In this work we searched for the presence of inactivating mutations in NANOS3 and BMP15 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis (10 familial cases) and 40 patients with secondary amenorrhea without FSHR and SF1 mutation. We also searched for inactivating mutations in coding and proximal promoter region of STRA8 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis, 16 ovotesticular disorder of sex development (DSD) patients and five 46XX testicular DSD patients all SRY negative and molecular defects in DAX1, WNT4 and SOX9 gene. In NANOS3 we identified the mutation p.E120K in homozygous state, the first associated with DG 46,XX phenotype. This missense mutation was identified in two sisters with 46XX GD and affects a zinc finger domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In BMP15, a new nonsense mutation p.Q115X was identified two sisters in homozygous state and in one sporadic case of secondary amenorrhea in heterozygous state. The premature codon STOP affects the pro-peptide domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In STRA8, only a previously described polymorphism (rs7805859) was identified without any other variation in coding or proximal promoter region. In conclusion, we identified for the fist time mutation in NANOS3 associated with DG 46XX and corroborate the role of BMP15 in this phenotype. Disorders of gonadal development 46,XX may be involved with differentiation and maintenance of ovarian germ cells.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MonicaRO_TESE.pdf: 9199361 bytes, checksum: c0ccdbb9830c327846e159e62e15732a (MD5) Previous issue date: 2014-07-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The flyingfish, Hirundichthys affinis (G?nther, 1866) (Exocoetidae) and ballyhoo half beak, Hemiramphus brasiliensis (Linnaeus, 1758) (Hemiramphidae) are marine fish species of commercial value, which contribute to artisanal fishery production of Rio Grande do Norte, Brazil. Besides the economic importance, these fish are important from an ecological point of view, being components in pelagic food chain, where they are the preferred prey of larger predators of high commercial value. This study aimed to determine the reproductive strategies of H. affinis and H. brasiliensis and the fishery production of H. affinis in the northern coast of Rio Grande do Norte. The results are presented in the form of six cientific articles and a review paper. The first article presents the morphometric measurements and meristic counts which confirmed the taxonomic status, population structure in length-weight and the gonad development of H. affinis through macroscopic observations of the ovaries and testes. Females of this species were bigger and heavier than males. The second article describes the reproductive tactics, such as, sex ratio, length at first sexual maturity, histological aspects of gonads, fecundity and spawning season, that indicate the reproductive strategy of H. affinis. The third article shows annual changes in the fishery production of H. affinis in Cai?ara do Norte, during the period of 1993 to 2010, emphasizing the relevance of this fish in total fishery production of Rio Grande do Norte, besides registering the fall in production in the years 2008 to 2010. The fourth article describes the population structure, with respect to the length and weight, the length-weight relationship, growth type and sex ratio of Hemiramphus brasiliensis. The fifth article describes the reproductive biology of H. brasiliensis, with details about sex ratio, length at first sexual maturity, fecundity, type of breeding and spawning season. The sixth article deals with the reproductive strategy of H. brasiliensis. The review paper presents the topic of age determination of tropical fish using analysis of otoliths. Both species use the coastal waters of Cai?ara do Norte for reproductive purposes. The flying fish, H. affinis migrates from the oceanic waters to the coastal waters to reproduce, coinciding with the rainy season. H. affinis presents total spawning and a seasonal reproductive strategy. However, H. brasiliensis lives and reproduces in the coastal waters displaying partial spawning and an equilibrium reproductive strategy / O peixe-voador, Hirundichthys affinis (G?nther, 1866) (Exocoetidae) e a agulha preta, Hemiramphus brasiliensis (Linnaeus,1758) (Hemiramphidae) s?o peixes marinhos de valor comercial, que contribuem para a produ??o pesqueira artesanal do Rio Grande do Norte, Brasil. Esses peixes s?o importantes na teia alimentar pel?gica, pois constituem as principais presas preferidas de predadores de alto valor comercial. Este trabalho teve como objetivo determinar as estrat?gias reprodutivas de H. affinis e de H. brasiliensis e a produ??o pesqueira de H. affinis no litoral Norte do Rio Grande do Norte. Os resultados est?o apresentados sob a forma de seis artigos cient?ficos e um artigo de revis?o. O primeiro artigo aborda as medidas morfom?tricas e contagens mer?sticas que confirmaram a taxonomia da esp?cie, a estrutura da popula??o em peso-comprimento e o desenvolvimento das g?nadas de H. affinis, atrav?s de observa??es macrosc?picas dos ov?rios e test?culos. Foi verificado que as f?meas s?o maiores e mais pesados do que os machos. O segundo artigo descreve ?s t?ticas reprodutivas, tais como, propor??o sexual, comprimento da primeira matura??o sexual, aspectos histol?gicos das g?nadas, fecundidade e per?odo de desova, que indicam a estrat?gia reprodutiva de H. affinis. O terceiro artigo mostra a varia??o anual da produ??o de H. affinis em Cai?ara do Norte, durante o per?odo de 1993 a 2010, dando ?nfase a relev?ncia desse peixe na produ??o pesqueira no RN, incluindo o registro da queda na produ??o durante os anos de 2008 a 2010. O quarto artigo apresenta a estrutura populacional, no que tange ao comprimento e peso, a rela??o peso-comprimento, o tipo de crescimento e a propor??o sexual de Hemiramphus brasiliensis. O quinto artigo apresenta a biologia reprodutiva de H. brasiliensis, com detalhes sobre a propor??o sexual, o comprimento da primeira matura??o sexual, a fecundidade, o tipo e o per?odo de desova. O sexto artigo descreve a estrat?gia reprodutiva de H. brasiliensis. O artigo de revis?o aborda o tema de determina??o da idade dos peixes tropicais atrav?s de ot?litos. As duas esp?cies utilizam o litoral de Cai?ara do Norte para fins reprodutivos. H. affinis migra das ?guas oce?nicas para as ?guas costeiras, coincidindo com o per?odo chuvoso. H. affinis apresenta desova total e a estrat?gia reprodutiva do tipo sazonal. Enquanto, H. brasiliensis vive e reproduz nas ?guas costeiras apresentando desova parcelada e uma estrat?gia reprodutiva do tipo de equil?brio

Os distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal são doenças genéticas heterogêneas. Os testes genéticos que utilizam o sequenciamento de genes candidatos pelo método de Sanger é efetivo para o diagnóstico etiológico em menos de 40% desses pacientes. O sequenciamento de nova geração é uma ferramenta eficaz no diagnóstico de pacientes com DDSs. No presente estudo, utilizamos o sequenciamento exômico paralelo em larga escala (SEPLE) para identificar variantes alélicas potencialmente causadoras dos DDSs. Pacientes com síndrome de regressão testicular embrionária (SRTE) familial, membros de duas famílias brasileiras não relacionadas (família 1: dois irmãos afetados e pais não afetados e família 2: indivíduo índice, irmã não afetada e sobrinho afetado, filho da irmã do índice) foram selecionados inicialmente. Estes pacientes apresentavam micropenis, testículos ausentes ou disgenéticos e ausência de útero. O DNA genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico e o SEPLE foi realizado usando a plataforma Illumina-HiSeq-2500. Uma nova variante em heterozigose, c.923C > T, (p.Arg308Gln), no DHX37 foi identificada em todos os membros afetados das duas famílias brasileiras. O sequenciamento por Sanger confirmou a presença da variante em todos os afetados, no pai não afetado da F1 e na mãe não afetada do F2. A presença de efeito fundador da variante nestas duas famílias foi excluído, através da análise de 29 marcadores localizados no cromossomo 12q. Trinta e cinco pacientes com 46, XY DDS por anormalidades do desenvolvimento gonadal (6 com SRTE e 29 com disgenesia gonadal) esporádicos foram incluídos na pesquisa de variantes no DHX37 por Sanger ou por painel de genes candidatos (Plataforma Illumina-HiSeq-2500). As variantes c.923C > T, (p.Arg308Gln) em heterozigose e a variante c.451G > A, (p.Arg151Trp) em homozigose foram identificadas no DHX37 em dois pacientes com SRTE esporádicos. As variantes c.142C > T (p.Ala48Thr) e c.2020G > A (p.Arg674Trp) foram identificadas em heterozigose em dois pacientes esporádicos com disgenesia gonadal (DG). De acordo com o American College of Medical Genetics e Genomics guideline (ACMG), as variantes foram classificadas como provavelmente patogênicas (p.Arg308Gln e p.Arg674Trp), variante de significância clínica incerta (p.Arg151Trp) e variante benigna (p.Ala48Thr). Três variantes identificadas no DHX37 eram causadoras de doença em mais de três das ferramentas de previsão in silico utilizadas. Nenhuma das novas variantes no DHX37 foi encontrada nas bases de dados da população disponíveis (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD e abraOM) com uma frequência maior do que 0,01%. O padrão de metilação da região promotora do DHX37 dos membros afetados e não afetados das famílias 1 e 2 e controles femininos e masculino foi analisado utilizando o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). Um sítio CpG hipometilado na região promotora do DHX37 foi observado apenas no pai da F1 quando comparado com as amostras dos filhos afetados, membros da F2 e controles. A análise imuno-histoquímica do padrão de expressão da proteína DHX37 foi realizada em amostras de testículos de oito indivíduos com diferentes idades cronológicas. Esta analise revelou que no tecido testicular de recém-nascidos, indivíduos em idade puberal e adultos, o DHX37 estava expresso em células germinativas em diferentes estágios de maturação (presentes nas espermatogonias, espermatócitos e espermátides e ausente nos espermatozoides). Este achado sugere que a proteína DHX37 pode ter um papel no processo de desenvolvimento das células germinativas. O DHX37 (12q24.31) codifica uma proteína DEAH (Asp-Glu-Ala-His) que pertence às famílias RNA helicases cujos membros estão envolvidos em quase todos os processos relacionados ao RNA, bem como ao controle do crescimento, proliferação e processos de diferenciação celular. Pacientes descritos com deleções na região 12q24.31, que contém o DHX37, apresentavam características sindrômicas e anormalidades genitais, como hipospadias ou micropenis. A presença de anormalidades genitais nestes pacientes reforça a hipótese de que o DHX37 está envolvido na etiologia dos DDSs 46,XY. Em conclusão, identificamos fortes evidências de um novo gene, o DHX37, envolvido no processo de desenvolvimento e manutenção das gônadas masculinas. Estudos complementares serão necessários para esclarecer o papel exato do DHX37 nas redes reguladoras de genes que controlam o desenvolvimento sexual humano / 46,XY disorders of sex development (DSD) associated with abnormalities of gonadal development are heterogeneous genetic diseases. Genetics testing using Sanger sequencing of candidate genes is effective for diagnosis in less than 40% of these patients. Next-generation sequencing has been a powerful genetic diagnostic tool in the investigation of DSD patients. In the present study, we used the whole exome sequencing (WES) to identify potentially DSD-causing allelic variants. Patients with familial embryonic testicular regression syndrome (ETRS) of two non-related Brazilian families (Family 1 (F1)- two affected brothers and the unaffected parents; Family 2 (F2)- index patient, his unaffected sister and an affected nephew, the son of the index\'s sister) were initially selected. The patients had micropenis, absent or dysgenetic testes and no uterus. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes and WES was performed using the Illumina-HiSeq-2500 platform. A novel heterozygous variant, c.923C > T, (p.Arg308Gln), in the DHX37 gene was identified in all affected members of the two Brazilian families and in F1\'s father. Sanger sequencing confirmed the presence of the variant in the all of the affected members and in F1\'s father and in F2\'s mother. The presence of a founder effect in these families was investigated using 29 markers located on chromosome 12q and was ruled out. Thirty-five additional patients with sporadic 46,XY DSD associated with abnormalities of gonadal development (6 with ETRS and 29 with gonadal dysgenesis) were screened for variants in this novel candidate gene using Sanger or NGS-based targeted sequencing panel of DSD candidate genes (Illumina-HiSeq-2500 platform). The heterozygous variant c.923C > T (p.Arg308Gln) and the homozygous variant c.451G>A, (p.Arg151Trp) in the DHX37 were identified in two sporadic SRTE patients. The heterozygous variants c.142C > T (p.Ala48Thr) and c.2020G > A (p.Arg674Trp) were identified in two sporadic 46,XY gonadal dysgenesis (GD) patients. According to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines (ACMG) the variants were classified as likely pathogenic (p.Arg308Gln, p.Arg674Trp), variant of uncertain clinical significance (p.Arg151Trp and) and benign variant (p.Ala48Thr); and all three of them were disease causing in more than three of the in silico prediction tools used. None of the novel DHX37 variants identified were found in the available population databases (EXAC, 1000GENOME, ESP6500, gnomAD and abraOM) in more than 0.01%. Segregation analysis of DHX37 allelic variants was performed in 5 families and resulted in the autosomal dominant with incomplete penetrance and recessive inheritance patterns. DNA methylation pattern of the DHX37 promotor region of F1 and F2\'s affected and unaffected members and gender-matched controls was analyzed using the Infinium Methylation EPIC BeadChip (Illumina). One hypomethylated CpG site in the promoter region of the DHX37 was only observed in F1\'s father compared with the affected siblings, F2\'s members and controls. Immunohistochemical analysis of DHX37 protein expression pattern was performed on testis samples of eight individuals with different chronological ages. This analysis revealed that in the testicular tissue of newborns, pubertal and adults, the DHX37 was expressed in different stages of germ cells maturation (present in spermatogonia, spermatocytes and spermatids and absent in spermatozoa). This finding suggests that DHX37 protein might have a role in the process of germ-cells development. The DHX37 (12q24.31) encodes a DEAH (AspGlu- Ala-His) protein of the RNA helicase families, whose members are involved in almost all RNA-related process such as the control of cell growth, proliferation and differentiation processes. Previously described patients with 12q 24.31 deletions, which contains DHX37, showed syndromic features and genital abnormalities as hypospadias or micropenis. This phenotype reinforces the hypothesis that DHX37 is involved in the etiology of disorders in male sex development. In conclusion, a novel gene, the DHX37, involved in the process of development and maintenance of male gonads was identified. Further studies will be necessary to clarify the exact role of the DHX37 in the gene regulatory networks controlling human sex development