Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées dont l'un des rôles est d'empêcher le raccourcissement progressif de l'extrémité des chromosomes suite à la réplication et à l'instabilité génomique due à la recombinaison de l'extrémité de chromosomes. Malgré le rôle des télomères dans la protection de l'extrémité des chromosomes contre les mécanismes de réparation de l'ADN et de recombinaison, de nombreuses protéines de ces voies jouent des rôles essentiels dans l'homéostasie télomérique et la stabilité des chromosomes. Parmi elles, la protéine RAD50 appartenant au complexe MRE11/RAD50/XRS25(NBS1) et l'endonucléase structure spécifique XPF/ERCC1 sont localisées aux télomères ; ces deux complexes connus pour leur rôle dans les voies de réparation de l'ADN ainsi que dans les études sur la recombinaison. Nous avons identifié deux rôles différents pour la protéine RAD50 dans la maintenance télomérique et dans la protection des extrémités des chromosomes, en contexte de présence et absence de la télomérase. L'absence d'AtRAD50 augmente significativement le nombre de fusions chromosomiques impliquant des télomères raccourcis. Nous proposons que ce rôle protecteur des télomères raccourcis de RAD50 est le résultat de sa fonction de contraindre la recombinaison entre chromatides soeurs et ainsi d'éviter les évènements de fusions par les extrémités. Nous avons recherché le ou des mécanismes impliqué(s) dans ces évènements de fusions chromosomiques chez les mutants atrad50 en réalisant des croisements entre les plantes déficientes pour ATRAD50 et des plantes déficientes pour des gènes codant des protéines des voies de réparation par recombinaison non-homologue et homologue. Au contraire de la situation en cellules de mammifères, nous n'avons pas observé d'instabilité chromosomique chez les plantes mutantes correspondantes pour XPF (AtRAD1) or ERCC1 (AtERCC1). Cependant, en absence de la télomérase, la mutation de l'un de ces deux gènes entraîne une augmentation précose et significative de l'instabilité chromosomique sans accélération générale de la perte des répétitions télomériques, mais associée à la présence de fragments ADN extrachromatiques visibles en cytologie. Une analyse intensive par FISH a permis d'identifier ces ADN comme des bras entiers spécifiques de deux chromosomes. Nos données indiquent un rôle protecteur de RAD1/ERCC1 comme l'invasion de l'ADN simple brin télométrique dans des séquences télomériques interstitielles. Le fait que les mutations de rad1 (ou ercc1) augmentent dramatiquement l'instabilité chromosomique des mutants télomérase a des implications très importantes pour les modèles des rôles de la recombinaison aux télomères.

Des motifs structuraux largement impliqués dans les processus de modulation de la courbure membranaire sont les hélices amphipathiques. Parmi eux, un senseur de la courbure exhibant des propriétés particulières a été identifiée récemment : ALPS (ArfGAP1 Amphipathic lipid packing sensor). Il a été montré que son interaction avec la membrane était indépendante des charges Žlectrostatiques En effet, le modèle actuel suggère que les résidus hydrophobes soient les responsables de l'ancrage d'ALPS ˆ la membrane en reconaissant les défauts d'empaquetage lipidique. Par simulations par dynamique moléculaire des différentes membranes lipidiques avec le motif ALPS, nous montrons que ce senseur exhibe une considérable liberté conformationnelle et structurelle qui l'habilitent ˆ explorer les défauts d'empaquetage aux niveaux des têtes polaires ainsi qu'au niveau des chaînes aliphatiques. Nous proposons des nouvelles perspectives au niveau atomique de la reconnaissance des défauts d'empaquetage lipidique par ALPS o la déformabilité et flexibilité structurale ainsi que les propriétés dynamiques et physiques de la membrane jouent un r™le prépondérant.

Yersinia pestis, l'agent de la peste, est une bactérie à Gram-négatif classée comme agent pathogène ré-émergent et potentielle arme de bioterrorisme. De plus, l'apparition d'une souche multi-résistance de cette bactérie souligne la nécessité de mieux comprendre comment cette bactérie hyper-virulente interagit avec son hôte. Afin d'identifier des facteurs génétiques de vulnérabilité à la peste, notre laboratoire travaille sur la réponse de souris résistantes versus sensibles à Y. pestis. Notre stratégie pour identifier les facteurs génétiques impliqués dans la résistance/sensibilité à la peste combine une approche de cartographie de QTL (Quantitative Trait Locus) et d'analyse d'expression génique. Nous avons précédemment décrit la lignée SEG/Pas, issue de Mus spretus, comme la première résistante à une souche virulente de Y. pestis, alors que la plupart des lignées murines de laboratoire, telle que la lignée C57BL/6J, sont extrêmement sensible à la bactérie. Des croisements entre SEG/Pas et C57BL/6J nous ont permis d'identifier trois QTL impliqués dans la résistance à Y. pestis, localisés sur les chromosomes 3, 4 et 6. Deux des QTL (situés sur les chromosomes 4 et 6) ont pu être confirmés par l'analyse de lignées congéniques. Plus de 40 % des femelles bi-congéniques hétérozygotes pour ces deux QTL ont survécu à l'infection, alors que tous les témoins C57BL/6J ont succombé. La dissection de ces deux QTL par l'analyse de lignées sous-congéniques, nous a permis d'affiner l'architecture génétique de la résistance à la peste chez SEG/Pas. Nous avons conclu qu'un minimum de quatre facteurs génétiques, au sein de ces deux QTL, sont nécessaires pour augmenter la résistance à Y. pestis chez la Souris. Cependant, la production de plusieurs lignées congéniques portant le QTL situé sur le chromosome 3, dont une lignée triple congénique, ne nous a pas permis de confirmer l'existence de ce QTL. En parallèle de l'analyse génétique, nous avons déterminé que les macrophages de SEG/Pas et de C57BL/6J présentaient des caractéristiques différentes après exposition à Y. pestis. Une analyse différentielle du profil transcriptionnel des macrophages de ces deux lignées a été réalisée à l'aide de puces à ADN. Nos résultats montrent une forte activation de la production cytokinique dans les macrophages de SEG/Pas en réponse à la bactérie, activation qui n'est pas observée dans la lignée C57BL/6J. Ces résultats suggèrent que les souris SEG/Pas sont capables de mettre en place une réponse immune innée plus forte ou peut-être plus précoce que C57BL/6J. Nous avons ensuite étudié par qRT-PCR l'expression en cinétique de 44 gènes dans des macrophages de SEG/Pas, C57BL/6J et des bi-congéniques portant les QTL sur les chromosomes 4 et 6. Cette étude nous a permis de confirmer que les souris SEG/Pas sont capables se mettre en place une forte réponse inflammatoire lors de l'infection. Cependant, aucune différence significative n'a été observée entre la lignée bicongénique et la lignée parentale C57BL/6J. D'autres expériences seront nécessaires afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la résistance intermédiaire de cette lignée. La dissection génétique associée à l'analyse de l'expression génique de ces lignées résistante et sensible permet d'augmenter notre compréhension de la réponse de l'hôte à Y. pestis.

La connaissance de la diversité génétique de R. solanacearum autant que la connaissance du déterminisme génétique de la résistance sont importantes pour établir une stratégie de lutte contre cette bactérie ubiquiste. Elles permettent de choisir et d'orienter des méthodes de lutte et le développement d'outils de contrôle de quarantaine adaptés. Dans un contexte scientifique de plus en plus tourné en génétique par l'approche plante modèle et dans lequel les Solanacées occupent la place de plante pionnière d'une part, et d'autre part par l'émergence de contournement des résistances liées à la grande diversité génotypique et phénotypique de R. solanacearum (au point où on parle ici de complexe d'espèce), l'objectif de cette thèse est de contribuer à établir les bases d'un programme d'amélioration des Solanacées contre cette phytobactériose majeure au Cameroun. En recourant à une approche moléculaire, notamment la méthode de caractérisation phylophasique qui décrit la diversité génétique des souches de R. solanacearum en quatre phylotypes et séquevars, nous avons révélé l'existence de trois phylotypes dans ce pays d'Afrique dont la diversité agro-climatique lui vaut le surnom d'" Afrique en miniature ". Ces phylotopes sont le I (Asiaticum), II (Americanum) et III (Africanum). Les souches du phylotype III du Cameroun se sont révélées génétiquement distinctes des souches africaines de référence originaires du Zimbabwe et de l'Océan Indien. Les souches isolées sur pomme de terre dans les hauts plateaux de l'Ouest du Cameroun se classent dans les deux phylotypes, à savoir le II (r3-bv2) et le III. Ces souches du phylotype II et III des hauts plateaux de l'Ouest infectent aussi bien la pomme de terre que la tomate, et pourraient constituer une menace économique pour ces cultures dans cette région. Dans cette étude, les souches du phylotype I émergent en zone forestière humide comme une contrainte majeure à la culture des Solanacées. Ce constat a orienté le choix d'une souche de ce phylotype (CMR143) dans les travaux de la cartographie génétique de la résistance chez le piment. Pour ce faire, deux géniteurs de résistance différents CM334 et PM687 ont été considérés. Ces études génétiques ont montré une forte héritabilité de la résistance au flétrissement bactérien chez le piment. La détection de QTL par analyse de variance (ANOVA), par cartographie d'intervalle, simple (SIM) et composite (CIM), ont révélé l'existence de 3 à 6 QTLs et d'interactions digéniques dans le contrôle de la résistance du piment au flétrissement bactérien. Ces résultats confirment le caractère oligogénique de la résistance du piment au flétrissement bactérien. En mettant ensemble ces QTLs et ces interactions digéniques, 47 à 64 % de la variance phénotypique sont expliqués selon le caractère de résistance considéré. Par ailleurs, il est montré que la résistance du piment au flétrissement bactérien est fortement associée à la limitation de l'envahissement de la tige par la bactérie. De plus, cette étude a mis en évidence le caractère phylotype-spécifique de la résistance, car seulement 33% de facteurs génétiques contribuent au contrôle du flétrissement bactérien lors de tests avec le phylotype 2. La localisation de ces derniers permet de conclure en validant partiellement l'hypothèse de synténie entre la tomate et le piment.

C. albicans est le pathogène opportuniste le plus fréquemment incriminé lors de candidoses nosocomiales. Sa paroi est une cible majeure pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques. Une classe majoritaire des protéines de paroi est composée par les protéines à ancre GPI dont la famille la plus étendue est représentée par les protéines Iff. La fonction des 12 protéines Iff est largement inconnue, mais des indications ont été récemment obtenues pour trois d'entre elles. Hyr1, régulée par la morphogenèse, a été identifiée comme un facteur de virulence, Iff4 est impliquée dans l'adhérence aux plastiques et Iff11, la seule protéine secrétée de la famille, est impliquée dans la biosynthèse de la paroi et dans la virulence. Dans ce travail, nous avons montré que les gènes de cette famille, à l'exception de HYR1, étaient peu exprimés en conditions de croissance au laboratoire et également in vivo chez la souris. Le gène IFF2 est cependant fortement induit sur milieu minimum en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants nuls homozygotes pour chacun de ces gènes, sauf pour IFF3 et IFF9, identiques à 99% en séquence et probablement essentiels. Les mutants obtenus ne présentent aucun défaut détectable au niveau de la biosynthèse de la paroi, de leur réponse au pH, à un stress oxydatif ou à une forte température. Ils ne sont pas davantage affectés dans leur adhérence sur cellules épithéliales HeLa ou dans leur survie en présence de macrophages J774. En milieu de croissance des cellules HeLa, la délétion de IFF2, IFF6, IFF7 et IFF8 semble cependant affecter la transcription d'IFF3 et d'IFF9, suggérant l'existence de mécanismes de régulations croisées.

Candida albicans est un pathogène opportuniste présent à l'état commensal chez 75% de la population. Il s'agit du premier pathogène d'origine fongique (4ème cause d'infections nosocomiales) responsable d'infections superficielles chez les personnes immunocompétentes ou d'infections profondes chez les personnes immunodéprimées. Les protéines à ancre GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol) de C. albicans, situées à l'interface entre la levure et les cellules de l'hôte, semblent être les plus aptes à moduler la réponse immunitaire. Au cours de cette étude, une banque de surexpression et de sécrétion d'une vingtaine de domaines fonctionnels putatifs issus de protéines à ancre GPI potentiellement exposées à la surface a été construite. Le crible réalisé a permis d'identifier sept polypeptides impliqués dans la modulation de la réponse des cellules macrophages et trois polypeptides ayant des propriétés immunogènes. Dans un deuxième projet, nous avons démontré que la protéine à ancre GPI Rbt1 spécifique des hyphes de C. albicans avait des propriétés d'adhésines aux substrats abiotiques et contribuait à la formation de biofilm et d'agrégats. La caractérisation de cette protéine a permis d'apporter des données nouvelles concernant l'exposition en surface de protéines membranaires suivant la forme morphologique de C. albicans.

La cachexie est un syndrome clinique et métabolique caractérisé par une perte de tissu adipeux et de tissu musculaire, fréquemment observé chez les patients atteints de cancer. La myostatine (Mstn) régule négativement la masse musculaire. Bien que la régulation des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la masse musculaire joue un rôle central dans la cachexie associée au cancer, les relations existant entre la Mstn et les mécanismes physiopathologiques restent largement inconnues. Suite à l'inoculation de cellules Lewis lung carcinoma (LLC) à des souris, nous avons montré que l'invalidation du gène de la Mstn (souris Mstn-/-) confère une résistance au développement de la cachexie associée au cancer par rapport à des souris sauvages. La déficience en Mstn prévient la perte de masse musculaire et réduit la croissance tumorale, 35 jours après l'injection des cellules LLC, et est associée à un allongement de la durée de vie des souris. L'invalidation du gène de la Mstn provoque aussi une augmentation de l'apoptose des cellules LLC et une diminution de l'expression de gènes impliqués dans la prolifération et le métabolisme tumoraux. L'activation des systèmes protéolytiques ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, due au développement tumoral, est réduite voire supprimée dans le muscle des souris Mstn-/-. L'accumulation de céramides intramusculaires, un sphingolipide formé suite à une lipolyse exacerbée, est corrélée à la perte de masse musculaire, suggérant que les céramides pourraient être un médiateur cellulaire impliqué dans la cachexie associée au cancer. Ces résultats montrent que la Mstn joue un rôle essentiel dans la cachexie associée au cancer

Le développement d'une médecine personnalisée nécessite la mise au point de sondes permettant la détection des marqueurs d'une pathologie au stade le plus précoce possible. Ce mémoire décrit la synthèse et l'évaluation de sondes ciblées permettant de réaliser des images en IRM ou en scintigraphie. Ces sondes sont construites par fonctionnalisation d'un châssis moléculaire préparé par une réaction à trois composants. La propargylamine résultante possède plusieurs points d'ancrage pour introduire les ligands destinés au ciblage et deux groupes chélatants pour l'imagerie. Ce châssis possède aussi en position terminale un groupement réactif pour le fixer sur des petites molécules polyfonctionnelles, des dendrimères ou des protéines. Une technique de criblage à flux rapide, basée sur l'utilisation des puces à petites molécules, a été utilisée pour la détection des ligands. Les molécules déposées sur la puce proviennent soit des C-glycosides complexes préparés selon le concept de la synthèse orientée vers la diversité, soit de la chimiothèque du laboratoire. Ces puces ont permis l'identification de ligands de plusieurs protéines comme la protéine VPR de la capside du virus du sida. Un criblage secondaire par RMN a confirmé l'interaction protéine-petite molécule. Les sondes portant un flavonoïde pour cibler les cellules tumorales de l'endothélium ont été traitées par une solution de sel de gadolinium puis leurs propriétés ont été évaluées par IRM. Les premiers résultats indiquent que ces composés offrent un contraste de 2 à 4 fois supérieurs aux agents de contraste usuellement utilisés. Leur évaluation biologique sera réalisée prochainement.