This thesis examined the enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS, E.C. 4.2.1.52) from the pathogen Mycobacterium tuberculosis. DHDPS is a validated antibiotic target for which no potent inhibitor based on substrates, intermediates or product has been found. The importance of the homotetrameric quaternary structure in E. coli DHDPS has been demonstrated by the 100-fold decrease in activity observed in a dimeric variant, DHDPS-L197Y, created by site-directed mutagenesis. This suggested a new approach for inhibitor design: targeting the dimer-dimer interface and disrupting tetramer formation. DHDPS catalyzes the first committed step in the biosynthetic pathway of meso-diaminopimelic acid, a critical component of the mycobacterial cell wall. In this study, wild-type M. tuberculosis DHDPS was thoroughly characterized and compared with the E. coli enzyme. A coupled assay was used to obtain the kinetic parameters for M. tuberculosis DHDPS: KM(S) ASA = 0.43 (±0.02) mM, KMpyruvate = 0.17 (±0.01) mM, and kcat = 138 (±2) s 1. Biophysical techniques showed M. tuberculosis DHDPS to exist as a tetramer in solution. This is consistent with the crystal structure deposited as PDB entry 1XXX. The crystal structure of M. tuberculosis DHDPS showed active-site architecture analogous to E. coli DHDPS and a dimeric variant of M. tuberculosis DHDPS was predicted to have reduced enzyme activity. A dimeric variant of M. tuberculosis DHDPS was engineered through a rationally designed mutation to analyze the effect of disrupting quaternary structure on enzyme function. A single point mutation resulted in a variant, DHDPS-A204R, with disrupted quaternary structure, as determined by analytical ultracentrifugation and gel-filtration chromatography. DHDPS-A204R was found to exist in a concentration-dependent monomer-dimer equilibrium, shifted towards dimer by the presence of pyruvate, the first substrate that binds to the enzyme. The secondary and tertiary structure of DHDPS-A204R was analogous to wild-type M. tuberculosis DHDPS as judged by circular dichroism spectroscopy and X ray crystallography, respectively. Surprisingly, this disrupted interface mutant had similar activity to the wild type enzyme, with a kcat of 119 (±6) s-1; although, the affinity for its substrates were decreased: KM(S) ASA = 1.1 (±0.1) mM, KMpyruvate = 0.33 (±0.03) mM. These results indicated that disruption of tetramer formation does not provide an alternative direction for drug design for DHDPS from M. tuberculosis. Comparison with the recently discovered dimeric DHDPS from Staphylococcus aureus shed further light on the role of quaternary structure in DHDPS. In M. tuberculosis DHDPS-A204R and the naturally dimeric enzyme, the association of monomers into the dimer involves a greater buried surface area and number of residues than found in E. coli DHDPS-L197Y. This provides a framework to discriminate which DHDPS enzymes are likely to be inactive as dimers and will direct future work targeting the dimer-dimer interface of DHDPS as an approach for drug design.

Little is known about amino acid (AA) requirements in horses despite muscle mass accretion being of importance to an athletic species. Isotope methods for determining AA requirements and whole-body protein synthesis (WBPS) had not been previously used in growing horses. The first study herein was the first to apply isotope methods to determine WBPS in growing horses. In the study, weanling colts received two different levels of crude protein. Whole-body protein kinetics indicated that WBPS was greater when the weanlings were fed the diet with a greater crude protein content (P<0.05). The second study sought to determine a lysine requirement for yearling horses using the indicator AA oxidation (IAAO) method. Despite using six dietary levels of lysine; three above and three below the current recommendation, no breakpoint could be determined. Phenylalanine kinetics were not affected by lysine level (P>0.05), but plasma lysine increased linearly with lysine intake (P<0.0001). After comparing dietary AA intakes with current AA requirement recommendations, threonine was a candidate for the limiting AA in the diets used in the first two studies. The objective of the next two studies was to determine if threonine supplementation would increase WBPS. Weanling colts fed a grass forage and commercial concentrate were supplemented with threonine in one study, while adult mares fed a high fiber diet and low threonine concentrate were supplemented with threonine in the other study. In neither case were whole-body protein kinetics affected by threonine supplementation (P>0.05). However, multiple plasma AA concentrations were affected by supplementation (P<0.05) in both studies, suggesting that supplementation of a single AA can affect the metabolism of other AAs. The final study conducted was aimed at improving the IAAO method for use in horses. Intravenous isotope infusion was compared to a less invasive oral infusion. Both infusion methods produced stable plateaus and by calculation, the splanchnic extraction of phenylalanine was found to be 27%. Additional research is needed to determine AA requirements for horses. These studies add insight into equine AA requirements and metabolism and the confirmation of the oral isotope infusion method will allow future experiments to be less invasive.

A detailed mechanistic investigation of the previously reported ruthenium pseudo-dipeptide-catalyzed asymmetric transfer hydrogenation (ATH) of aromatic ketones was performed. It was found that the addition of alkali metals has a large influence on both the reaction rate and the selectivity, and that the rate of the reaction was substantially increased when THF was used as a co-solvent. A novel bimetallic mechanism for the ruthenium pseudo-dipeptide-catalyzed asymmetric reduction of prochiral ketones was proposed. There is a demand for a larger substrate scope in the ATH reaction, and heteroaromatic ketones are traditionally more challenging substrates. Normally a catalyst is developed for one benchmark substrate, and a substrate screen is carried out with the best performing catalyst. There is a high probability that for different substrates, another catalyst could outperform the one used. To circumvent this issue, a multiple screen was executed, employing a variety of ligands from different families within our group’s ligand library, and different heteroaromatic ketones to fine-tune and to find the optimum catalyst depending on the substrate. The acquired information was used in the formal total syntheses of (R)-fluoxetine and (S)-duloxetine, where the key reduction step was performed with high enantioselectivities and high yield, in each case. Furthermore, a new iron-N-heterocyclic carbene (NHC)-catalyzed hydrosilylation (HS) protocol was developed. An active catalyst was formed in situ from readily available imidazolium salts together with an iron source, and the inexpensive and benign polymethylhydrosiloxane (PMHS) was used as hydride donor. A set of sterically less demanding, potentially bidentate NHC precursors was prepared. The effect proved to be remarkable, and an unprecedented activity was observed when combining them with iron. The same system was also explored in the reduction of amides to amines with satisfactory results. / <p>At the time of doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 2: Manuscript.</p>

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 197 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 188-197). Also available online.

Thesis (Ph.D. in Neuroscience) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 108-118). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph.D. in Microbiology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2005. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 201-223).

Die vorliegende Untersuchung diente, nach der grundlegenden Vorgehensweise im Rahmen des exponentiellen N-Verwertungsmodelles (GEBHARDT 1966, Samadi und Liebert 2008), die Aminosäurewirksamkeit beim Masthähnchen unter spezifischer Fokussierung der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein zu bewerten und neue Erkenntnisse zum Idealprotein-Konzept beim Mastgeflügel zu erhalten. Dazu wurden Stoffwechsel- und Wachstumsversuche mit männlichen Ross 308 Broilerküken in jeweils zwei Altersperioden (Starter- und Growerperiode) durchgeführt. Die Beantwortung der komplexen Fragestellung erforderte ein Herangehen in drei separaten Versuchskomplexen, die folgende Zielstellungen umfassten: Untersuchungskomplex I: Ermittlung des NMR (N-Erhaltungsbedarf) und NRmaxT (theoretisches maximales N-Retentionsvermögen) Untersuchungskomplex II: vergleichende Bertachtung der Methioninwirksamkeit zweier Methioninquellen (DL-Methionin (DLM) und 2-Hydroxy-4-methylthiobuttersäure (MHA)) und Ermittlung des Methioninbedarfs in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis Untersuchungskomplex III: Ableitung eines idealen Aminosäurenverhältnisses unter Betrachtung der Aminosäuren Lysin, Threonin, Tryptophan, Arginin, Isoleucin und Valin Folgende Resultate wurden erzielt: NMR und NRmaxT Der in einem N-Bilanzversuch ermittelte N-Erhaltungsbedarf (NMR) für Ross 308 Broiler betrug für die Altersperiode 10. - 20. LT 295 mg/LMkg0,67 pro Tag und für die Altersperiode 25. - 35. LT 313 mg/LMkg0,67 pro Tag. Da die Ergebnisse, des in beiden Altersabschnitten analysierten N-Erhaltungsbedarfes sehr ähnlich waren, wurde der Mittelwert dieser beiden Parameter eruiert. Der durchschnittliche, als Arbeitswert für den täglichen N-Erhaltungsbedarf angenommene NMR betrug, für die unter der Studie betrachtete Genetik, somit 304 mg/LMkg0,67 pro Tag. Die Bewertung des theoretischen Potentials für die tägliche N-Retention (NRmaxT) männlicher Broilerküken der genetischen Herkunft Ross 308 entsprach für die Altersperiode 10. - 20. LT 3991mg/LMkg0,67 pro Tag und 3110 mg/LMkg0,67 pro Tag für die Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse demonstrierten, dass das genetische Potential zur Proteindeposition wachsender Broiler mit zunehmendem Alter sank. Methionin-Wirksamkeit Gegenüber der Negativkontrolle konnte durch die DL-Methionin- / MHA-Zulagen bzw. DL-Methionin- / MHA-Zulagen in Kombination mit Cystein der tägliche Zuwachs und der Futteraufwand signifikant verbessert werden. Beim Vergleich der relativen Wirksamkeit von DLM und MHA in dieser Arbeit zeigt sich eine Überlegenheit des DLM in allen Mischungen, mit Ausnahme der zweiten Met+Cys-Supplementationsstufe in der Growerperiode, bei der eine Wirksamkeit von 100 erzielt wurde. Die MHA-Wirksamkeit variierte in einem Bereich zwischen 62% und 100% in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis und dem Gehalt an Met bzw. Cys in der Diät. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass mit zunehmendem Anteil an Methionin sowie innerhalb des Methioninlevels ein zunehender Anteil an Cystein in der Diät, die Wirksamkeit von MHA relativ zu DLM senkte. Ableitungen zum täglichen Methioninbedarf Die abgeleiteten Werte zum täglichen Methioninbedarf bezogen sich auf einen Rohproteinansatz von 6 - 10g/d (Starter) bzw. 12 - 20g/d (Grower) und lagen in einem Bereich von: 244 - 498 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 157 (Starter, 10. 21. LT) 230 - 500 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 196 (Grower, 25. 35. LT) Danach benötigte ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 500g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 6 - 10 mg/d eine Zufuhr von 154 313 mg Met/d und ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 1800g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 12 20 mg/d eine Zufuhr von 341 742 mg Met/d. Bei einer täglichen Futteraufnahme von 50g bzw. 130g ergaben sich notwendige Aminosäurekonzentrationen im Futter von 0,26 - 0,57% Methionin bzw. 0,31 - 0,63% Methionin. Für die Methioninbedarfswerte zeigte sich eine bestehende Abhängigkeit zum Met:Cys-Verhältnis bzw. Cys-Gehalt der Futtermischung. Ableitungen zum idealen Aminosäurenverhältnis N-Bilanz- und Wachstumsversuche zur Ermittlung der idealen Aminosäurenverhältnisse wurden durchgeführt. Aus den drei N-Bilanzversuchen ergab sich ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:61:17:106:59:69 für Broiler in der Altersperiode 10. - 20. LT sowie ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:65:17:106:65:82 für Broiler in der Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse bestätigten die schon für Lys:Thr bekannte Altersabhängigkeit. Neue Aspekte ergaben sich jedoch hinsichtlich Ile und Val, bei denen ebenfalls ein altersbedingter Anstieg relativ zum Lys beobachtet wurde. Unter Mittelwertbildung der beiden Wachstumsversuche ergaben sich folgende Aminosäurenverhältnisse: Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:62:18:95:68:72 für Broiler in der Altersperiode 0. - 21. LT und Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:73:15:92:73:82 für Broiler in der Altersperiode 21. - 35. LT.

Die vorliegende Untersuchung wurde in drei Experimenten mit drei unterschiedlichen Genotypen von Tilapien durchgeführt. Der erste Genotyp war Oreochromis niloticus (rein männlich), der zweite rote Tilapia Oreochromis mosambicus x Oreochromis hornourm und der dritte Hybriden aus O. niloticus x (O. mosambicus x O. hornourm). Alle drei Experimente wurden durchgeführt, um die Wachstumskapazität und die maximale N-Retention von Tilapien festzustellen, sowie die physiologische Reaktion der unterschiedlichen Genotypen auf unterschiedliche Proteinstufen in Verbindung mit unterschiedlichen Energiestufen herauszufinden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden 10 semi gereinigte Diäten mit Fischmehl und Weizengluten (3 : 1, konstantes Verhältnis) für ein N-Steigerungsexperiment gemischt. Die Diäten 1 bis 5 enthielten 5 Rohproteinstufen zwischen 16 und 48% RP mit einem Energiegehalt von 15.6 MJ ME/kg isoenergetisch. Das Protein-Energie-Verhältnis betrug zwischen 10.30 und 29.10 g Protein/MJ ME. Die Diäten 6 bis 10 enthielten ebenfalls 5 Rohproteinstufen von 16 bis 48 % mit einer angepassten Energiegehalt von 13.6 bis 17.6 ME MJ/kg. Das Protein-Energie-Verhältnis reichte von 11.60 bis 25.90 g Protein/MJ ME. Threonin wurde als die zuerst limitierende Aminosäure berechnet (ausgenommen Diät 8 mit Threoninergänzung). Jedes Experiment dauerte 10 Wochen. Das durchschnittliche Körpergewicht der Fische betrug 12.3 ± 0.1g für Experiment 1, 12.4 ± 0.1g für Experiment 2 und 12.3 ± 0.1g für Experiment 3. In jedem Experiment wurden 25 Fische pro Becken mit drei Wiederholungen in einem Kreislaufsystem bei 27 - 28ºC gehalten. Die Fische wurden semi ad libitum per Hand gefüttert, wobei die Menge 7 % des Körpergewichts am Anfang des Experiments und 4 % am Ende des Experiments betrug. Am Ende eines jeden Experimentes wurden 90 Fische zur Bestimmung der Ganzkörperzusammensetzung entnommen. Der Einfluß der Futtermischungen auf die Wachstumsrate, die Körperzusammensetzung, den Nährstoffansatz sowie die Futteraufnahme und Nährstoffnutzung wurden ausgewertet. Weiterhin wurden die Resultate zum Proteinansatz für Schätzungen des maximalen Proteinretentionsvermögens verwendet, die auf einem exponentiellen N-Verwertungsmodell für das Wachstum von Tieren basieren (GEBHARDT, 1966).