京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20612号 / 医博第4261号 / 新制||医||1023(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 増永 慎一郎, 教授 溝脇 尚志, 教授 小泉 昭夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 μmol/min/mg bei optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-G eingebettet ist. Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET Substraten hinweist.

Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kDa Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt einen pI von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-Nitrophenyl-Estern und wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR hingegen wurden durch die TfCa mit einem Km von 0,5 mM und einer Vmax von 9,3 μmol/min/mg bei optimalen Bedingungen (60°C, pH 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A-G eingebettet ist. Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET Substraten hinweist.:Inhaltsverzeichnis 1 Einführung 1 1.1 Actinomyceten 1 1.1.1 Klassifizierung 1 1.1.2 Thermobifida (Thermomonospora) fusca 2 1.2 Biopolyester Cutin und Suberin 4 1.2.1 Bestandteile des Cutins 4 1.2.2 Bestandteile des Suberins 5 1.2.3 Struktur der Biopolymere 7 1.3 Hydrolasen 12 1.3.1 Struktur und katalytischer Mechanismus 12 1.3.2 Carboxylesterasen 16 1.3.3 Lipasen 19 1.3.4 Cutinasen 22 1.4 Polyethylenterephthalat 23 1.4.1 Konventionelle PET-Faserbehandlung 24 1.4.2 Charakterisierung von PET 26 1.4.3 Biofunktionalisierung von PET 30 1.4.4 PET-Hydrolasen 38 1.5 Zielsetzung 49 2 Material und Methoden 50 2.1 Materialien 50 2.1.1 Verwendete Mikroorganismen 50 2.1.2 Verwendete Enzyme 50 2.1.3 Größenstandards 51 2.1.3.1 Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare) 51 2.1.3.2 Roti®-Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH) 51 2.1.3.3 SpectraTM Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas) 51 2.1.3.4 PageRulerTM plus prestained protein ladder (Fermentas) 51 2.1.3.5 Kalibrierungskit für pI Bestimmung (pH 3-10, GE Healthcare) 52 2.1.3.6 Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare) 52 2.1.4 Chemikalien 53 2.1.5 Geräte und Materialien 55 VI 2.1.6 Software 58 2.1.7 Nährmedien 58 2.1.8 Suberin- und Cutin-Präparationen 60 2.1.9 PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen 60 2.1.10 Puffer und Lösungen 60 2.2 Mikrobiologische Methoden 65 2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung 65 2.2.2 Mikroskopische Untersuchungen 65 2.2.3 Trockengewichtsbestimmung 65 2.3 Proteinchemische Methoden 66 2.3.1 Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa 66 2.3.2 Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut2 67 2.4 Analytische Methoden 67 2.4.1 Esterase-Aktivitätsbestimmung 67 2.4.1.1 Bestimmung mittels Spektrophotometer 68 2.4.1.2 Bestimmung mittels Plattenleser 68 2.4.2 Cutinase-Aktivitätsbestimmung 68 2.4.3 PCL-Abbauuntersuchung 69 2.4.3.1 Bestimmung mittels Hofbildung 69 2.4.3.2 Bestimmung mittels Plattenleser 69 2.4.4 Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976) 69 2.4.5 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 70 2.4.5.1 Esteraseaktivitäts-Färbung 70 2.4.5.2 Coomassie-Färbung 71 2.4.5.3 Silberfärbung der Proteine 71 2.4.6 Bestimmung des pI 71 2.4.7 Bestimmung der Molaren Masse 72 2.4.8 Bestimmung der Temperatur und pH-Wert Stabilität 72 2.4.9 Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren 72 2.4.10 Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-NP Ester 72 2.4.11 Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR 73 2.4.12 Bestimmung optimaler Temperatur und pH-Wert für die Hydrolyse von CTR 73 2.4.13 N-terminale Sequenzierung 73 2.4.14 MALDI-TOF Sequenzierung 74 2.4.15 Abbaustudien 74 VII 2.4.16 Analytik der PET Abbauprodukte 75 2.4.17 Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien 75 2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen 76 3 Ergebnisse und Diskussion 77 3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca 77 3.1.1 Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium 77 3.1.2 Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium 78 3.1.2.1 Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern 78 3.1.2.2 Esterasebildung mit einer Suberinpräparation 81 3.1.2.3 Esterasebildung mit PET-Fasern 83 3.1.3 Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM 43792 und DSM 43793 mit PET-Fasern und Diethylterephthalat 85 3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 95 3.2.1 Aufreinigung 95 3.2.1.1 Aufreinigung der TfCa 95 3.2.1.2 Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen 105 3.2.2 pI der TfCa 113 3.2.3 Molare Masse der TfCa 113 3.2.4 Temperatur- und pH-Stabilität der TfCa 114 3.2.5 Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa 117 3.2.6 Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa 118 3.2.7 Optimale Temperatur und optimaler pH-Wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa 119 3.2.8 Cutinaseaktivität der TfCa 120 3.2.9 PCL-Abbau durch die TfCa 121 3.2.10 N-terminale Sequenz der TfCa 122 3.2.11 MALDI-TOF Sequenzierung der TfCa 123 3.2.12 Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen 126 3.2.13 Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen 128 3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen 138 3.3.1 Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen 140 3.3.2 Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen 148 3.3.3 Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen 151 4 Zusammenfassung 165 VIII 5 Literaturverzeichnis 166 6 Publikationen 181 7 Poster und Vorträge 182 8 Lebenslauf 183

Das Hauptziel einer Strahlentherapie, die möglichst vollständige Vernichtung des Tumorgewebes bei einer höchstmöglichen Schonung des umliegenden Gewebes und der Risikoorgane, kann mit Kohlenstoffionen besser als mit Elektronen oder Gammastrahlung erreicht werden. Ionen haben ein inverses Tiefen-Dosisprofil, sie geben einen Großteil ihrer Energie am Ende ihres Weges durch Materie ab. Dieses Energieabgabeverhalten, die wohl definierte Reichweite und die erhöhte biologische Wirksamkeit im Tumor prädestinieren zum Beispiel Kohlenstoffionen für die Behandlung inoperabler, gegen konventionell eingesetzte Strahlung resistenter Tumoren. Allerdings führen diese Eigenschaften der Strahlung auch dazu, dass Veränderungen der Dichte der Materie im Strahlweg zu einer Verschiebung des Maximums der Energieabgabe und damit zu einer deutlichen Veränderung der Dosisverteilung führen. Ein Monitoring der reichweitesensitiven Ionenbestrahlungen ist somit erforderlich. Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die normalerweise dazu benutzt wird, die Verteilung eines injizierten Positronenemitters im Gewebe zu bestimmen, kann hier eingesetzt werden. Durch Kernreaktionen der einfliegenden Kohlenstoffionen mit Atomkernen des Gewebes kommt es zur Erzeugung von Positronenemittern, die über ihren Zerfall mit dem an der experimentellen Therapieanlage an der Gesellschaft für Schwerionenforschung installierten in-beam PET-Scanner nachgewiesen werden können. Da die Dosisverteilung und die erzeugte Aktivitätsverteilung durch verschiedene physikalische Prozesse bedingt sind, ist ein direkter Vergleich der PET-Messung mit der von den Ärzten und Medizinphysikern festgelegten Dosisverteilung nicht möglich. Aus der Dosisverteilung und dem Zeit-ablauf der Bestrahlung wird eine Vorhersage der Aktivitätsverteilung berechnet, die dann mit der Messung verglichen wird. Auf der Grundlage dieses Vergleiches ist die in-beam PET-Methode in der Lage, während der Behandlung Reichweiteabweichungen im Patienten, Ungenauigkeiten in der Positionierung und auch Fehler im physikalischen Strahlmodell aufzuzeigen. Trotz einer guten Anpassung der in der Vorausberechnung verwendeten physikalischen Modelle an die Realität kommt es zu Abweichungen, die nicht mit einer ungenauen Dosisapplikation begründbar sind. Diese sind zum größten Teil durch die metabolischen Vorgänge im Patienten bedingt, an denen die Positronenemitter teilnehmen. Diese Washout-Prozesse sind zwischen verschiedenen Patienten und verschiedenen Behandlungstagen nicht reproduzierbar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Quantifizierung des Washouts in Abhängigkeit verschiedener Parameter vorgenommen, deren Berücksichtigung zur Verbesserung der Vorausberechnung führt. Um eine flexiblere Positionierung des Patienten am raumfesten Bestrahlungssystem der GSI zu ermöglichen, wurde an der GSI ein Bestrahlungsstuhl entwickelt. Um auch bei der Bestrahlung sitzender Patienten eine in-beam PET-Messung zu ermöglichen, sind die beiden Detektor-Einheiten der PET-Kamera um die Strahlachse drehbar. Durch die hohe Eigenmasse der Detektoren kommt es jedoch zu Deformationen der idealen Kreisbahn. Um eine ortsgenaue Rekonstruktion der Daten zu ermöglichen, müssen diese Deformationen quantifiziert und korrigiert werden. Dies war ein weiteres Anliegen dieser Arbeit. Das wichtigste Ziel der vorliegenden Dissertation jedoch war, die in-beam PET-Methode auf neue Ionensorten zu erweitern. Es wurde gezeigt, dass die in-beam PET-Methode auch für 3He-Bestrahlungen angewendet werden kann. Dafür wurden Experimente an einem 3He-Strahl durchgeführt. Die Aktivitätsausbeute ist bei gleicher applizierter Dosis etwa dreimal so hoch wie bei 12C-Bestrahlungen. Die erreichbare Reichweite-Auflösung ist kleiner als 1 mm. Bei der Bestrahlung eines inhomogenen Phantoms wurde gezeigt, dass ein Kontrast zwischen verschiedenen Materialien auflösbar ist. Aus den experimentell bestimmten Reaktionsraten wurden Wirkungsquerschnitte für zu Positronenemittern führende Reaktionen abgeschätzt. Die in den 3He-Experimenten genommenen Daten wurden denen in Kohlenstoff-Ionen-Experimenten gewonnen sowie Literaturdaten für Protonenbestrahlungen gegenübergestellt. Ein Vergleich mit den Rechnungen des Simulationsprogrammes Shield-Hit erfolgte. Eine Zusammenstellung von Wirkungsquerschnittsmodellen und die aufgestellten Anforderungen an ein für in-beam PET verwendbares Simulationsprogramm sind vorbereitend für weitere Arbeiten.

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Master of Science / Department of Grain Science and Industry / Cassandra Jones / Salmonella contamination in animal food production facilities is a growing concern. The bacteria has been the cause of 40% of pet food recalls in the past 5 years, and there are potential human health implications because pet food is a direct human contact food. A potential method to reduce Salmonella contamination in pet food is through the use of acidifiers and desiccants to destroy and inhibit growth of bacteria. The objective of this thesis was to quantify Salmonella contamination in livestock feed and pet food manufacturing facilities, and propose mitigation measures to mitigate the presence of pathogens in animal food. Therefore, the objective of Experiment 1 was to investigate sources of Salmonella contamination throughout livestock feed (n = 2) and pet food (n = 2) manufacturing facilities on a specific sampling day. Salmonella was present in all four facilities. However, one of the livestock feed manufacturing facilities had more than double the Salmonella-positive locations than all other facilities. This experiment demonstrated that surface type and location should be taken into consideration when controlling Salmonella contamination. In Experiments 2 and 3, the use of a commercial powdered dry acidulant, sodium bisulfate, was studied as a coating of dog kibble to reduce and prevent Salmonella growth over time. The coating reduced Salmonella concentration, and its efficacy was not impacted by altering the bulk density or surface area of the kibble. Experiment 4 was conducted to determine the efficacy of sodium bisulfate added to poultry mash to reduce or prevent Salmonella growth over time. The inclusion of the dry acidulant did not reduce Salmonella concentration; however, storage time reduced Salmonella contamination in poultry feed. In summary, Salmonella contamination exists in manufacturing facilities, but the location and magnitude of contamination differs. Furthermore, sodium bisulfate effectively reduces Salmonella contamination when applied as a pet food coating, but not in poultry feed.

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Environmental stimuli associated with drug use are related to drug craving and relapse. The mechanism of cue-induced craving is thought to involve the release of dopamine (DA) in brain regions associated with reward and habit formation. The aim of the study was to investigate the role of DA in cue-induced craving in tobacco-dependent smokers using Positron Emission Tomography (PET) and a picture cue paradigm. Tobacco-associated cues were capable of eliciting significantly greater subjective reports of craving relative to neutral cues in tobacco smokers (n=6) in a neuroimaging environment. Using this cue paradigm and [11C]-(+)-PHNO PET (n=6), a non-significant trend towards a greater decrease in binding potential, indicative of dopamine release, was shown in selected brain regions of interest. These findings are similar to findings in cocaine-dependent individuals and suggest the involvement of dopamine in the response to smoking-associated cues in tobacco-dependent individuals.