Dans ce travail de thèse, plusieurs groupes de nouveaux complexes d'or(I) à base de carbènes N-hétérocyclique (NHC)contenant des bras amino-aliphatiques et aromatiques avec un potentiel intéressant dans des applications biomédicales ont été synthétisés et entièrement caractérisés. En outre, une série de complexes d'iridium(III) contenant des ligands NHC avec des activités anticancéreuses prononcées pour une application en thérapie photodynamique, a étépréparée et entièrement caractérisée. Le premier groupe représente une famille de complexes cationiques or(I) bis(NHC) contenant des bras latéraux amino-aliphatiques. Ces complexes ont étésynthétisés et étudiés pour leurs activités antiprolifératives vis-à-vis de quatre lignées cellulaires cancéreuses humaines et de la lignée cellulaire non cancéreuse MDCK. Dans cette série, la lipophilie est directement liée àl'activitécytotoxique contre les cellules cancéreuses. La deuxième famille de composés concerne les complexes cationiques or(I) bis(NHC) contenant des bras latéraux amino-aromatiques. La cytotoxicitéin vitro de ces complexes et de leurs proligands sur les lignées cellulaires représentatives du cancer de la prostate PC-3 et de la vessie T24 a étéévaluée. Tous ces complexes présentent des valeurs de Log P (lipophilie) supérieures àcelles de la première série de complexes en accord avec leur cytotoxicité plus élevée, mais une lipophilie trop élevée peut également conduire àune sélectivitéplus faible. Afin de développer un candidat-médicament avec une activitéet une sélectivité optimisées, nous avons conçu et synthétisé la troisième famille de complexes cationiques or(I) bis(NHC). Les valeurs de log P de cette série se situent entre la première série et la deuxième série. Ces complexes moins lipophiles sont moins cytotoxiques envers les lignées cellulaires saines (NIH3T3) et montre des activités anticancéreuses un peu plus faibles sur les cellules PC-3 que la deuxième série, avec néanmoins des valeurs de GI50 dans la gamme du nanomolaire. Les études mécanistiques sur deux complexes d'or(I) ont été réalisées. Les mesures d'absorption cellulaire ont montré une accumulation cellulaire rapide et une bonne biodisponibilitédes complexes, en accord avec l'activitéantiproliférative de ces deux complexes. De plus, les deux complexes inhibent la thiorédoxine reductase (TrxR), une cible commune pour les complexes d'or(I). La mort cellulaire induite par ces deux complexes est dépendante des espèces réactives de l'oxygène. En plus des activités anticancéreuses, nous avons également testédes complexes d'or(I) mono-NHC pour une autre application biomédicale, la leishmaniose, maladie parsitaire. Ils ont été testés in vitro sur les formes promastigotes et amastigotes axéniques de L. infantum. De plus, leur cytotoxicitéa étéévaluée sur les macrophages murins J774A.1 afin de déterminer leur sélectivitéd'action. Un autre sujet de cette thèse concerne les complexes d'iridium(III)-NHC. Trois familles de complexes ont étépréparées et caractérisées. La cytotoxicitéin vitro de tous les complexes sur les cellules cancéreuses de la prostate PC-3 et de la vessie T24, et les cellules non cancéreuses NIH3T3 a étéévaluée. De plus, tous les complexes sont des agents théranostiques, et les expériences de microscopie confocale d'un complexe ont montréqu'il pouvait être rapidement et efficacement absorbédans les cellules PC-3 et se localiser spécifiquement dans les mitochondries. De manière intéressante, ces complexes peuvent agir comme des photosensibilisateurs efficaces. La cytotoxicitéde ces complexes a étéaugmentée substantiellement après une irradiation lumineuse de 365 nm, ce qui suggère le potentiel élevéde ces agents anticancéreux théranostiques ciblant les mitochondries pour la thérapie photodynamique. / In this work of thesis, several groups of novel NHC-based gold(I) complexes containing aliphatic and aromatic amino-side arms with interesting potential in biomedical applications have been synthesized and fully characterized. Also, a series of iridium(III) complexes containing NHC ligands with pronounced PDT anticancer activities has been prepared and fully characterized. The first group represents a family of cationic bis(NHC)-gold(I) complexes containing aliphatic amino-side arms. These complexes have been synthesized and investigated for their antiproliferative activities towards four human cancer cell lines and the non-cancerous MDCK cell line. In this series, the lipophilicity correlates directly with the cytotoxic activity against cancer cells. The second family of compounds concerns cationic gold(I) bis(NHC) complexes containing aromatic amino-side arms. The in vitro cytotoxicity of these complexes and proligands on the representative PC-3 prostate and T24 bladder cancer cell lines has been evaluated. All these complexes show higher Log P values (lipophilicity) than the first series of complexes, and in line with this higher cytotoxicity, nevertheless too high lipophilicity can also lead to lower selectivity. In order to develop a drug candidate with optimized activity and selectivity, we designed and synthesized the third family of cationic gold(I) bis(NHC) complexes. The Log P values of this series were between the first series and the second series. The lower cytotoxicity towards non-cancerous NIH3T3 cells was found for this series of complexes whereas they also displayed less activities towards cancer cells than the second series. The mechanistic studies on two gold complexes by monitoring the cellular uptake showed the rapid cellular accumulation of the intact gold bis(NHC) and a good bioavailability, in good agreement with the antiproliferative activity of these two complexes. Moreover, both complexes inhibit TrxR, a common target for gold(I) complexes. The cell death induced by these two complexes was ROS-dependent. Besides anticancer activities, we also tested gold(I) mono-NHC complexes for other biomedical applications in parasite disease Leishmaniasis. They were screened in vitro against both promastigote and axenic amastigote forms of L. infantum. Moreover, their cytotoxicity was evaluated on the murine J774A.1 macrophages in order to determine their selectivity of action. Another topic of this thesis concerns iridium(III)-NHC complexes. Three families of theranostic iridium(III)-NHC complexes were prepared and characterized. The in vitro cytotoxicity of all the complexes against PC-3 prostate, T24 bladder cancer cells and non-cancerous NIH3T3 cells was evaluated. Moreover, all complexes are theranostic agents, and the confocal microscopy experiments of one complex showed that it can be quickly and effectively taken up into PC-3 cells and specifically localize into mitochondria. Interestingly, these complexes can act as efficient photosensitizers. The cytotoxicity of these complexes was increased substantially upon 365 nm light irradiation, which suggested the high potential to be mitochondria-targeting theranostic anticancer agents for photodynamic therapy.

Avaliar in vivo o efeito da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT), após tratamento endodôntico em sessão única, em dentes de cães com lesão periapical, em comparação ao tratamento em duas sessões com o uso de curativo de demora à base de hidróxido de cálcio. Material e Métodos: Após a indução experimental da lesão periapical e instrumentação dos canais radiculares, 48 dentes foram distribuídos nos seguintes grupos: I e III Uso de curativo de demora com pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen®); e II e IV -Tratamento em uma única sessão com utilização da aPDT. Os canais radiculares foram obturados e decorridos os períodos experimentais de 120 dias (Grupos I e II) e 180 dias (Grupos III e IV), os animais foram submetidos à eutanásia. Após processamento histotécnico, análise microscópica descritiva/semi-quantitativa, avaliação morfométrica do tamanho da lesão periapical em microscopia de fluorescência e análise radiográfica foram realizadas. Foram utilizados os testes de Kruskal Wallis e exato de Fisher (=0,05). Resultados: Na análise microscópica descritiva, os grupos I e III apresentaram áreas cementárias reparadas, com numerosos feixes colágenos no ligamento periodontal e presença suave de células inflamatórias. Nos grupos II e IV as áreas de reabsorção cementária não estavam reparadas, com reduzida presença de células e fibras e presença de células inflamatórias. Na análise semi-quantitativa do selamento biológico apical houve diferença significante (p<0,0001) entre os grupos I e II; e entre os grupos III e IV (p<0,0001). A análise em microscopia de fluorescência evidenciou diferença significante entre os grupos, após 120 dias (p=0,0004) e após 180 dias (p=0,0081), sendo que os grupos I e III apresentaram lesões periapicais menores. A porcentagem de redução radiográfica das lesões evidenciou diferença significante entre os grupos (p<0,05), com maior porcentagem de redução para os grupos I e III. Com relação à análise imunohistoquímica, nos grupos I, II e IV, as marcações para RANK, RANKL e OPG indicaram sinalização pró-reabsortiva, embora a marcação para RANKL no grupo I tenha sido pouco intensa. Já no grupo III, as marcações evidenciaram ocorrência de neoformação óssea. Conclusão: O tratamento em duas sessões com o uso de curativo de demora à base de hidróxido de cálcio promoveu maior redução no tamanho das lesões periapicais e estágio mais avançado de reparo, evidenciado pelos melhores resultados histopatológicos, imunohistoquímicos e radiográficos, em comparação ao tratamento em uma única sessão com utilização do protocolo de aPDT avaliado. / To evaluate one-session endodontic treatment with aPDT and two-session treatment with calcium-hydroxide (CH)-based dressing in dog\'s teeth with apical periodontitis. Methods: After experimental induction of apical periodontitis, 48 teeth were randomly assigned to the following groups: Group I (one-session treatment with aPDT 120 days); Group II (one-session treatment with aPDT 180 days); Group III (two-session treatment with CH-based dressing -120 days) and Group IV (two-session treatment with CH-based dressing -180 days). The animals were euthanized after 120 and 180 days. After histotechnical processing, microscopic and radiographic analyses were performed. Data were analyzed by Kruskal-Wallis and Fishers exact tests (=0.05). Results: In the microscopical analysis, Groups I and III presented repaired cemental areas, with various colagen bundles in the periodontal ligament and mild presence of inflamatory cells. In the groups III and IV the present resorbed cemental areas were not repired, with reduced number of cells and fibers and the presence of inflamatory cells. The semi-quantitative analysis of the apical clousure, there was a significant difference (p<0.0001) between groups I and II; and between groups III and IV (p<0.0001). In the fluorescence microscopy analysis, there was a significant difference between groups, aftter 120 days (p=0.0004) and after 180 days (p=0.0081). The groups I and III presented smaller periapical lesions. The percentage of radiographic reduction of lesions demonstrated a significant difference between groups (p<0.05) with a higher reducton in group I and II. Regarding the immunohistochemistry analysis, in the groups I, II and IV, RANK, RANKL and OPG staining indicated pro-resorption signaling; although the RANKL immunostaining in the group I were not intense. In the group III, the immunostaining demonstrated the occurrence of bone neoformation. Conclusion: Two-session treatment with CH based promoted more reduction in the periapical lesion size and more repair advanced stage, highlighting better histopathological, immunostaining and radiographic results in comparison with one-session treatment with aPDT protocol used.

A onicomicose é uma doença comum na lâmina ungueal, constituindo aproximadamente metade dos casos de infecção nas unhas. O tratamento convencional consiste na administração de antifúngicos e antibióticos por longos períodos. O aumento de linhagens microbianas resistentes aos fármacos disponíveis e a alta incidência deste tipo de infecção na população tornam importante o desenvolvimento de novas tecnologias e opções terapêuticas. A Terapia Fotodinâmica (TFD) consiste no emprego do fotossensibilizador (FS) ativado por luz em comprimento de onda adequado que, na presença de oxigênio, produz espécies reativas de oxigênio tóxicas que inativam os microrganismos. Os objetivos deste estudo foram: analisar o uso de curcumina e clorina como FSs; estudar mecanismos que auxiliam na penetração do FS na lâmina ungueal através da utilização de emolientes e novas formulações farmacêuticas; Desenvolver dispositivos projetados para iluminar as unhas dos pés e das mãos para o tratamento de onicomicose por TFD. Realizar a TFD com as tecnologias desenvolvidas em pacientes com onicomicose a fim de avaliar a eficácia, além de explorar novos métodos diagnóstico da doença com base em imagens térmicas e de fluorescência. OS resultados indicam que a curcumina é um FS mais efetivo que a clorina para o tratamento onicomicose por TFD. Também foi identificado que os veículos emulsão fornecem uma entrega superior de curcumina em unhas infectadas. Os dispositivos de iluminação desenvolvidos especificamente para a anatomia das unhas de pé e mãos também facilitaram a aplicação da TFD para o tratamento da onicomicose. Os novos veículos FS baseados em curcumina e os dispositivos de iluminação desenvolvidos foram avaliados em um estudo clínico com 30 pacientes. Este estudo indicou que a entrega de curcumina via emulsão foi mais eficaz do que a entrega via gel, conforme quantificado pelo número de sessões de TFD necessárias para resposta clínica positiva (6 semanas para emulsão e 10 semanas para gel). Finalmente, a viabilidade de realizar imagens térmicas e de fluorescência de unhas em pacientes com onicomicosis abre a possibilidade de explorar essas modalidades de imagem como ferramentas complementares para o diagnóstico não invasivo de onicomicose. Em conclusão, devido à sua eficácia demonstrada, baixo custo e simplicidade para operar, as tecnologias desenvolvidas através deste trabalho facilitarão a adoção da TFD como um tratamento novo e efetivo da onicomicose. / Onychomycosis is a common disease of the nail plate and constitutes approximately half of the cases of nail infection. The conventional treatment of onychomycosis consists of the administration of anti-fungal drugs and antibiotics for long periods of time. Due to both the increase of microbial lines resistant to available drugs and the high incidence of this type of infections, it is highly relevant to develop new technologies and therapeutic options. Photodynamic Therapy (PDT) consists of the use of photosensitizers (FS) activated by light of specific wavelengths that, in the presence of oxygen, produces toxic reactive oxygen species that can inactivate the microorganisms. The objectives of this study were: to analyze the use of curcumin and chlorine as FSs for PDT therapy of onychomycosis; to identify mechanisms for enhancing the penetration of FS in the nail plate via the application of emollients and novel pharmaceutical formulations; to develop devices specifically designed for illuminating the nails of feet and hands for PDT treatment of onychomycosis; to perform PDT with the developed technologies on patients with onychomycosis and evaluate its efficacy; to explore novel diagnosis methods for onychomycosis based on thermal and fluorescence imaging. Our results indicate that curcumin is a more effective FS than chlorine for the PDT treatment of onychomycosis. It was also identified that emulsion vehicles provide a superior delivery of curcumin into infected nails. The illumination devices developed specifically for the anatomy of foot and hand nails also facilitated the application of PDT for the treatment of onychomycosis. The novel FS vehicles based on curcumine and the developed illumination devices were evaluated in a pilot clinical study with 30 patients. This study indicated that delivery of curcumine via emulsion was more effective than the delivery via gel, as quantified by the number of PDT sessions needed for positive clinical response (6 weeks for emulsion vs. 10 weeks for gel). Finally, the feasibility to perform both thermal and fluorescence imaging of nails in patients with onychomycosis opens to the possibility of exploring these imaging modalities as complementary tools for the noninvasive diagnosis of onychomycosis. In conclusion, due to its demonstrated efficacy, low cost and simplicity to operate, the technologies developed through this work will facilitate the adoption of PDT as a novel and effective treatment of onychomycosis.

Síntese, aspectos estruturais, propriedades fotoquímicas, fotofísicas e fotoindução para avaliação citotóxica in vitro de derivados de [Ru (Pc)] (PC = ftalocianina) são descritos neste trabalho. O desenvolvimento ftalocianinas utilizando anéis macrocíclicos, substituídos e não substituídos simetricamente, coordenados com o centro metálico de rutênio permitiu a obtenção de diferentes compostos. Coordenação de ligantes derivados de óxido nítrico (NO) na posição axial do rutênio (II) permitiu obter [Ru(NO)(Pc)(NO2)], um complexo liberador de NO quando submetido ao processo de redução. Os complexos foram caracterizados por FTIR, UV-Vis, 1H RMN e espectrometria de massas. As propriedades fotoquímicas de complexos como ftalocianinas de rutênio (II) têm sido investigadas por fotólise a laser em diferentes comprimentos de onda. Na irradiação de luz em 660 nm em solução aquosa aerada, observamos o fotoprocesso com a produção de oxigênio singleto. Pode-se observar a relação do rendimento quântico de oxigênio singleto e dos fotossensibilizadores utilizados para sua produção. O oxigênio singleto para [Ru (Pc-R)] segue a ordem [Ru(Pc)]> [Ru (Pc-DCBz)]> [Ru(Pc-DMX)] com DCBz = ácido 4-(3,4-dicianofenoxi) benzóico e DMX = 4,5-bis (2,5-dimetilfenoxi) ftalonitrilo. Estudos fotobiológicos são destacados com particular enfoque na irradiação de luz em 660 nm com interesse para aplicações de terapia fotodinâmica (TFD). Neste contexto, temos também a avaliação citotóxica em linhagens de células B16F10 do efeito sinérgico entre NO e oxigênio singleto quando comparado ao complexo [Ru(Pc)], um composto que é apenas produtor de oxigênio singleto. O NO parece potencializar a ação de oxigênio singleto uma vez que em ensaios de viabilidade celular, o complexo [Ru(NO)(Pc)(NO2)] é pelo menos 40% mais ativo que [Ru(Pc)], considerando 8,93 J / cm2 como uma potência. Considerando apenas a produção de oxigênio singleto encontramos a espécie [Ru(Pc-DCBz)] mais citotóxica nas linhagens B16F10 e MCF-7, sob irradiação em 660nm. Com base em todos os estudos, concluímos que citotoxicidade é dependente tanto da localização subcelular quanto do rendimento quântico de oxigênio singleto. A citotoxicidade pode ser reforçada pela produção de NO, seguido por irradiação de luz na janela terapêutica. / Synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(Pc)] (pc = phthalocyanine) derivatives are described in this work. Use of an unsubstituted or symmetrically substituted phthalocyanine ring coordinated to the central ruthenium allowed to obtain different compounds. Coordination of nitric oxide (NO) derivative ligands on axial position of ruthenium(II) ion permitted to obtain [Ru(NO)(Pc)(NO2)] a NO deliver agent under reduction process. The complexes were characterized by FTIR, UV-Vis, 1H NMR and mass spectrometry. The photochemical properties of (phthalocyanine)ruthenium(II) like complexes have been investigated by laser photolysis at different wavelengths. At 660 nm light irradiation in aerated aqueous solution we observed photoprocesses with singlet oxygen production. We have addressed the relationship of the singlet oxygen quantum yield and the photosensitizers used in its generation. The singlet oxygen for [Ru(Pc-R)] follows the order [Ru(Pc)] > [Ru(Pc-DCBz)] > [Ru(Pc-DMX)] with DCBz = 4-(3,4-dicianofenoxy)benzoic acid and DMX = 4,5-bis (2,5-dimethylfenoxy)ftalonitrile. Photobiological studies are highlighted with particular focus on light irradiation on 660 nm with interest for photodynamic therapy (PDT) applications. In this way we also have compared the synergism effect of NO and singlet oxygen production with [Ru(Pc)] as a compound producer of singlet oxygen only by means of cytotoxicity in B16F10 cell line. The NO seems to leverage the singlet oxygen action once [Ru(NO)(NO2)(Pc)] cell viability is at least 40 % more active than [Ru(Pc)] considering 8.93 J/cm2 as a potency. Considering only singlet oxygen production we found [Ru(Pc-DCBz)] more cytotoxic specie in B16F10 and MCF7 cell lines, under irradiation in 660 nm. Based on all studies, we have concluded that citotoxycity is dependent on subcellular localization as well singlet oxygen quantum yield. The cytotoxicity could be enhanced by NO production followed by light irradiation on the therapeutic window.

Foi avaliada a eficácia da terapia fotodinâmica, empregando o fotossensibilizante azuleno e laser de baixa intensidade, associado ao preparo químico-cirúrgico convencional (hipoclorito de sódio a 0,5% e endo-ptc) de canais radiculares de dentes de cães. Para isso, foram utilizados 20 cães provenientes do Hospital Veterinário da FMVZ/USP, cada qual apresentando um dente unirradicular com morte e contaminação pulpar e, radiograficamente, lesão de rearefação óssea periapical. Os cães foram divididos em dois grupos de dez animais. O primeiro grupo foi submetido ao tratamento endodôntico, iniciando a anti-sepsia através do preparo químico-cirúrgico e, posteriormente a terapia fotodinâmica. O segundo grupo foi submetido ao tratamento endodôntico, iniciando a anti-sepsia pela terapia fotodinâmica e, posteriormente foi realizado o preparo químico-cirúrgico. Os resultados mostraram que a terapia fotodinâmica intracanal tem eficácia semelhante à anti-sepsia do preparo químico-cirúrgico. A ordem de emprego do preparo químico-cirúrgico e terapia fotodinâmica não influencia no resultado de anti-sepsia. O emprego de azuleno irradiado por laser de baixa potência tem grande eficácia sobre espécies de enterococos no interior dos condutos, e é eficaz na diminuição do número de bactérias totais intraradiculares. Os resultados sugerem que há uma tendência em afirmar que o emprego de azuleno irradiado por laser possa diminuir a quantidade de espécies de leveduras. / The photodynamic therapy efficacy was evaluated, using the photosensitizer azulene and low intensity laser, associated to the conventional root canal therapy (0,5% sodium hipoclorite and endo-ptc endodontic paste) in teeth of dogs. Twenty dogs from the Veterinary Hospital of the FMVZ/USP were used, each one presenting one uniradicular tooth with death and pulp contamination and, radiographic injury of periapical bone reabsorption. These dogs were divided in two groups of ten animals. The first group was submitted to the endodontic treatment, starting the anti-sepsis through the conventional root canal therapy and, subsequently the photodynamic therapy. The second group was submitted to the endodontic treatment, starting the anti-sepsis by photodynamic therapy and, subsequently the conventional root canal therapy. The results showed that intracanal photodynamic therapy has similar efficacy compared to the anti-sepsis of the conventional root canal therapy. The order of application of the conventional root canal therapy and photodynamic therapy does not interfere in the result of anti-sepsis. The use of irradiated azulene by low intensity laser has strong efficacy over species of enterococus inside the ducts. The use of irradiated azulene by low intensity laser is efficient in the reduction of total numbers of intracanal bacterias. The results suggest that there is a tendency to affirm that the use of irradiated azulene by low intensity laser can reduce the quantity of species of yeast.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) que na presença de luz e oxigênio molecular gera espécies altamente reativas de oxigênio (EROs) que levam as células tumorais à morte por apoptose ou necrose. Os FSs do tipo clorina apresentam problemas de agregação reduzindo sua eficácia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi sintetizar, caracterizar e testar novas clorinas não agregáveis em meio fisiológico e determinar sua ação fotodinâmica em células tumorais (HEp-2 e HeLa) e não tumorais (Vero). As moléculas 10-a e 10-b foram obtidas com rendimentos de 68% e as moléculas 11-a e 11-b com 64% de rendimento. Foram caracterizadas por RMN 1H, 13C, UV-Vis e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). Os valores de rendimento quântico de oxigênio singleto (&Phi;0) das clorinas foram comparáveis a uma molécula comercial análoga usada em TFD, a verteporfina (Visudyne&reg;). As clorinas sintetizadas apresentaram valores de rendimento quântico de fluorescência (&Phi;f) maiores que o Visudyne&reg;, além de uma baixa fotodegradação. O coeficiente de absorção molar (&epsilon;) das clorinas 10a-b e 11a-b exibiram valores maiores em meio aquoso apresentando uma auto-agregação menor que o Visudyne&reg;. O coeficiente de partição (Log P) obtido para a verteporfina (1.61 ± 0.10) foi maior que das clorinas 10a-b e 11a-b (1,20 ± 0,04 e 1,40 ± 0,03) respectivamente, evidenciando uma maior lipofilicidade e dificuldade de solubilização em meio aquoso em relação às clorinas. Os valores de Concentração Inibitória Média (IC50) das clorinas 10-a e 10-b nas linhagens celulares HEp-2 e HeLa foram menores que os determinados para a verteporfina pelo método de MTT, estas clorinas foram três e duas vezes mais potentes do que Visudyne&reg; respectivamente. As análises por microscopia de fluorescência mostraram que as quatro clorinas sintetizadas levam à morte celular predominantemente por apoptose nas duas linhagens tumorais. A acumulação intracelular determinada por microscopia confocal mostrou que as clorinas 10a-b exibiram uma maior penetração em relação às clorinas 11a-b através da membrana citoplasmática nas células tumorais, assim como, nas não tumorais. Dessa forma, as clorinas sintetizadas mostraram-se mais fotoestáveis, mais fototóxicas e mais solúveis em meio fisiológico do que o Visudyne&reg;, vantagens consideráveis para o uso como fotossensibilizadores para TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique for the treatment of cancer that uses a photosensitizer (PS) that in the presence of light and molecular oxygen generates highly reactive oxygen species (ROS) that lead tumor cells to death by apoptosis or necrosis. Chlorine-like PSs exhibit aggregation, reducing its photodynamic efficacy in PDT. Thus, the objective of this study was to synthesize, characterize and test new chlorins sterically-prevented for self-aggregation in physiological medium, as well as determining their photodynamic response in tumor cells (HEp-2 and HeLa) and non-tumor cells (Vero). The chlorins designated 10-a and 10-b (yield: 68%), 11-a and 11-b (yield: 64%) were characterized by 1H, 13C, UV-Vis, and high resolution mass spectrometry (HRMS). The singlet oxygen quantum yield (&Phi;0) values of the chlorins were comparable to an analogous commercial molecule used in PDT, verteporfin (Visudyne&reg;). The synthesized chlorins shown fluorescence quantum yield values (&oslash;f) higher than Visudyne&reg;, in addition to low photodegradation. The molar absorption coefficient (&epsilon;) of chlorins 10a-b and 11a-b exhibited higher values in aqueous medium showing less self-aggregation than Visudyne&reg;. The partition coefficient (Log P) obtained for verteporfin (1.61 ± 0.10) was higher than that of chlorins 10a-b and 11a-b (1.20 ± 0.04 and 1.40 ± 0.03), respectively, indicating a greater lipophilicity and difficulty of solubilization in aqueous medium comparing to chlorins. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of 10-a and 10-b chlorins in HEp-2 and HeLa cell lines were lower than those determined for verteporfin by the MTT method. These chlorins were three and two times more potent than Visudyne&reg; respectively. Fluorescence microscopy analyzes displayed that the four synthesized chlorins lead to cell death predominantly by apoptosis in the two tumor cells. Intracellular accumulation determined by confocal microscopy showed that chlorinas 10a-b exhibited a greater penetration with respect to chlorins 11a-b through the cytoplasmic membrane in tumor cells, as well as in non-tumor cells. Thus, the chlorins synthesized in this study showed to be more phototoxic and more soluble in physiological medium than Visudyne&reg;, considerable advantages for the use as photosensitizers for PDT.

O adenocarcinoma de ducto pancreático (PDAC) é a quarta causa de morte em decorrência de neoplasias nos países ocidentais. Atualmente, a cirurgia ressectiva é a única possibilidade de cura para a doença, porém, a recidiva tumoral acontece em menos de um ano após a intervenção cirúrgica, mesmo com a quimioterapia adjuvante. A terapia fotodinâmica (PDT) é uma alternativa promissora no tratamento do câncer. No entanto, pouco se sabe sobre o uso da PDT em tumores pancreáticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da PDT com o azul de metileno (MB) como fotossensibilizador (MB-PDT) em induzir a morte de linhagens de PDAC humanas (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 e BxPC-3) e estudar a contribuição de vias de necrose regulada nos efeitos citotóxicos da terapia sobre estes modelos. Os resultados obtidos mostraram que a MB-PDT foi capaz de induzir a morte massiva das células de PDAC. Além disso, eles indicaram que há dois perfis de susceptibilidade entre as quatro linhagens estudadas quando submetidas a MBPDT com 4,5 J/cm2 de energia e 6min de irradiação. De acordo com os dados apresentados, a diferença nas sensibilidades das linhagens à terapia não está associada à diferenças na capacidade de incorporação do MB ou na localização sub-celular do fotossensibilizador nas diferentes células, uma vez que a localização é, predominantemente, lisossomal em todas elas. Adicionalmente, mostrou-se que as linhagens menos susceptíveis ao tratamento, MIAPaCa-2 e Panc-1, apresentam níveis significativamente menores de RIPK3 e MLKL, dois dos componentes do necrossomo, essenciais para a execução da necroptose. Além disso, foi visto que a MB-PDT induz um aumento de fosforilação de MLKL em AsPC-1, demonstrando a ativação da necroptose após a terapia nestas células, mas não em MIAPaCa-2 (menos responsiva à terapia com 4,5 J/cm2 deenergia e 6min de tempo de irradiação). Ainda, a inibição da via de sinalização necroptótica diminuiu significativamente as porcentagens de morte das células mais susceptíveis (BxPC-3 e AsPC-1), não alterando a resposta de Panc-1 e MIAPaCa-2, corroborando a ativação e importância da necroptose para a citotoxicidade da MB-PDT. Finalmente, neste trabalho foi mostrado que o aumento do tempo de irradiação, mantendo-se a quantidade total de energia aplicada no tratamento, melhora a eficiência da MB-PDT em induzir a morte das células que apresentam limitações para executar a necroptose, sugerindo que mais de uma via de morte esteja sendo ativada após a terapia e que o tempo de irradiação atuaria modulando esta ativação. Complementarmente, foi mostrado que os tempos maiores de irradiação aumentam o estresse oxidativo intracelular que é acompanhado por uma diminuição significativa do conteúdo intracelular de glutationa reduzida (GSH), indicando, preliminarmente, que a ferroptose pode estar sendo acionada após os protocolos mais longos de irradiação. Coletivamente, os resultados apresentados neste trabalho confirmam a eficiência da MB-PDT no tratamento de diferentes linhagens de PDAC, indicando que a necroptose está sendo ativada e contribuindo para a citotoxicidade da terapia sobre as células que não apresentam resistência à esta via de morte. Ainda, eles demonstram que o aumento do tempo de irradiação pode transpor a barreira de resistência de algumas linhagens à terapia, provavelmente por induzir a ativação de outras vias de necrose regulada, mostrando a importância da otimização do protocolo de tratamento no aumento da eficiência da MB-PDT sobre os tumores de pâncreas. Finalmente, os resultados confirmam a MB-PDT como alternativa eficaz no tratamento do PDAC, apresentando um amplo espectro de atuação sobre subtipos tumorais resistentes à vias clássicas de morte celular, uma característica importante no contexto de uma terapia anti-cancer. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of death due to neoplasms in western countries. Currently, resective surgery is the only therapetical approach to cure this disease, but tumor´s recurrence occurs less than one year after the surgery, even with adjuvant chemotherapy. Photodynamic therapy (PDT) is a promising alternative for the cancer treatment. However, the efficacy of PDT to treat pancreatic tumors as well as the mechanisms involved in the induction of tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to evaluate the efficacy of PDT using methylene blue (MB) as a photosensitizer (MB-PDT), in inducing death of human PDAC derived cell lines (AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa-2 and BxPC-3) and to deeper investigate the contribution of necroptosis to the cytotoxic effects of the therapy. We observed that MB-PDT was able to induce massive death of PDAC cells. Moreover, our results indicated that upon MB-PDT (4.5 J/cm2 energy and 6min of irradiation time), there were two susceptibility profiles among the four cell lines studied. Data also showed that this differential profile of cell response was neither associated with the differences in the MB incorporation capacity nor with the subcellular location of the photosensitizer, since the localization was predominantly lysosomal in all of tested cell lines. In addition, less susceptible cells, MIAPaCa-2 and Panc-1, showed significantly lower levels of RIPK3 and MLKL, two of the necrosome components, essential for triggering necroptosis. Furthermore, while MB-PDT (4.5 J/cm2 and 6min of irradiation) has been able to increase MLKL´s phosphorylation levels, an essential step in necroptosis induction, in AsPC-1cells, less responsive MIAPaCa-2 cells presented no variations on the phosphorylation state of this pseudokinase. Moreover, pharmacological inhibition of the necroptotic signaling pathway significantly decreased cell death percentages of the most susceptible cells (BxPC-3 andAsPC-1), without altering the response of Panc-1 and MIAPaCa-2, corroborating that activation of necroptosis was strongly involved in the cytotoxicity of MB-PDT. Finally, this work showed that increasing the irradiation time improved the efficacy of MB-PDT in killing cells which display limitations to perform necroptosis, suggesting that the irradiation time would be modulating the degree of oxidative stress generated and this stimuli would in turn, be responsible for triggering other regulated cell death pathways in a RIKP3 and MLKL independent way. Indeed, this increase in oxidative stress was accompanied by a significant decrease in GSH, a global indicatior of less antioxidant cell capacity, preliminarily pointing at the induction of ferroptosis by longer irradiation protocols. In summary, we demonstrated that MB-PDT is able to induce cell death in different PDAC cell lines and that different regulated cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction. Furthermore, it was demonstrated that increased irradiation time may overcome the resistance barrier of some cell lines, probably inducing the activation of other regulated cell death pathways, showing the importance of optimizing the irradiation protocol in order to maximize the efficacy of the therapy. Finally, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for pancreatic cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors displaying different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy.

O câncer é uma patologia responsável por um grande número de óbitos. Os tratamentos convencionais, quimioterapia e radioterapia, nem sempre são eficientes e, além disso, os efeitos colaterais são intrínsecos às terapias. A partir da década de 70 surgiu uma nova forma de terapia chamada de “terapia fotodinâmica" (“Photodynamic Therapy", PDT) que apresenta poucos efeitos colaterais quando comparada com as terapias convencionais. O princípio da PDT é introduzir no organismo um composto fotoativo e irradiar com luz visível o local a ser tratado, obtendo assim a forma ativa do composto que induz a morte das células cancerígenas. Os compostos atualmente usados em PDT possuem algumas desvantagens na sua aplicação que estimula a busca de outros compostos mais satisfatórios. Neste projeto foram estudados corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) que possuem boas vantagem para uso em PDT. O trabalho foi focado no estudo das características espectrais e energéticas dos BCD na interação com DNA, e o efeito da força iônica nessa interação para sugerir seu uso em fotoquimioterapia, principalmente em PDT. Foram estudados quatro BCD que se diferenciam pelo ângulo entre os cromóforos. As análises experimentais foram feitas através de métodos espectroscópicos de absorção ótica, fluorescência e dicroísmo circular, e as teóricas através de programas computacionais comerciais e um programa desenvolvido neste trabalho. Os resultados obtidos mostram que os BCD possuem alta afinidade com as moléculas de DNA, formando diferentes espécies que afetam nas características dos seus estados excitados. A presença de outros íons influencia as características dos corantes e a sua interação com DNA. Pelos resultados obtidos podemos considerar que os BCD apresentam boas características para aplicação em PDT e que estes resultados dão suporte para estudos futuros da interação destes corantes com sistemas naturais (células) e para fazer testes clínicos em animais. / Cancer is a pathology responsible for a great number of deaths. The conventional methods of treatment, chemotherapy and radiotherapy, are not always efficient, and multiple side effects are intrinsic for these therapies. In early 70’s appeared a new method called “Photodynamic Therapy" (PDT), that shows few side effects as compared with conventional therapies. The main idea of PDT is to introduce a fotoactive compound into the organism and then irradiate with visible light the site to be treated, producing the active form of the compound that induces the death of cancers cells. The compounds used for this purpose have some disadvantages in their application, which stimulates the search for best compounds. In this work were studied several cyanine dyes with two interacting chromophores (BCD), which seem advantageous for use in PDT. The aim is to study spectral and energetic features of BCD in the presence of DNA, and at various ionic strengths, to suggest their use in cancer photochemotherapy. Four BCD studied in this work were characterized by different angles between chromophores. The experimental analysis was made using various spectroscopic methods such as optical absorption, fluorescence and circular dichroism, and the theoretical treatment was based on computational programs both conventional and created in this work. The results show that BCD has high affinity with DNA molecules, forming various species thus changing the BCD excited state features. The presence of ions modifies the characteristics of dyes and their interaction with DNA. Analyzing the results we can conclude that the characteristics of BCD are promising for their application in PDT, and this makes reasonable future studies of the interaction of these dyes with natural systems such as cells culture and tumors in laboratory animals.

A prevenção das doenças periimplantares baseia-se em procedimentos de rotina na clínica, com a remoção mecânica do biofilme associada ou não de agentes antimicrobianos locais e sistêmicos. No entanto, o controle do biofilme oral sobre a superfície de implantes é dificultado particularmente sobre as superfícies rugosas do titânio, que apesar de facilitarem a osseointegração, também favorecem a formação do biofilme. Objetivos: Objetivou-se analisar in vitro o efeito da TFD (Terapia fotodinâmica) usando curcumina como fotossensibilizador sobre o biofilme formado na superfície de discos de titânio com superfície rugosa e lisa. Material e Métodos: Biofilme mono espécie de Streptococus gordonii, colonizador inicial do biofilme dental, foi formado em superfícies lisas (usinadas) e rugosas (tratadas) de discos de titânio por 72 horas. Os discos lisos e rugosos foram então distribuídos em 3 grupos: tratados por 5 minutos com curcumina (60?M), clorexidina 0,12% como controle positivo e solução de DMSO (dimetilsufóxido), etanol e água como controle negativo (veículo da curcumina). As amostras foram divididas em 2 sub-grupos: ativado por LED azul (455-492nm) por 7 minutos e não-ativado. A atividade metabólica do biofilme foi determinada pelo método de redução do Sal tetralisol XTT e os resultados analisados estatisticamente pela análise da variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey (p < 0,05). Resultados: Na ausência de luz, apenas o tratamento com clorexidina promoveu redução microbiana (controle positivo). O tratamento com curcumina ativada pela luz azul reduziu o número de bactérias viáveis no biofilme em 71% nos discos lisos e em 77% nos rugosos, não havendo diferença estatística com o controlepositivo.Conclusão: Os dados in vitro indicam que TFD associada à curcumina tem atividade sobre biofilme microbiano, sugerindo seu potencial no controle do biofilme oral sobre a superfície de titânio, e que este efeito independe da topografia da superfície. / Prevention of periimplant diseases is based on routine procedures in the clinic, with the mechanical removal of biofilm associated or not with local and systemic antimicrobial agents. However, the control of oral biofilm on the surface of implants is particularly difficult on the rough surfaces of titanium, which, although facilitating osseointegration, also favors biofilm formation. Objectives: The objective of this study was to analyze in vitro the effect of PDT using curcumin as a photosensitizer on the biofilm formed on the surface of titanium discs with a rough and smooth surface. Material and Methods: Biofilm mono species of Streptococus gordonii, initial colonizer of the dental biofilm, was formed on smooth (machined) and rough (treated) surfaces of titanium discs for 72 hours. The smooth and rough discs were then divided into 3 groups: treated for 5 minutes with curcumin (60 ?M), 0.1% chlorhexidine as a positive control and DMSO, ethanol and water solution as a negative control. The samples were divided into 2 subgroups: activated by blue LED (455-492nm) for 7 minutes and non-activated. The metabolic activity of the biofilm was determined by the reduction XTT salt method and the results analyzed statistically by ANOVA followed by the Tukey\'s test (p <0.05) Results: In the absence of light, only the chlorhexidine treatment promoted microbial reduction (positive control). The blue light-activated curcumin treatment reduced the number of viable bacteria in the biofilm in 71% in the smooth discs and in 77% in the wrinkles, and there was no statistical difference with the positive control. Conclusion: In vitro data indicate that PDT associated with curcumin has activity on microbial biofilm, suggesting its potential in the control of oral biofilm on the titanium surface, and that this effect is independent of surface topography.

Este estudo teve como objetivo avaliar o grau de manchamento dental, ap¨®s o tratamento endodôntico, quando aplicada a terapia fotodinâmica, utilizando-se os corantes azuis de metileno e de orto toluidina como fotossensibilizadores, atrav¨¦s do sistema RGB e K de cores do programa Adobe Photoshop. Vinte dentes humanos unirradiculares tiveram seus canais preparados pela t¨¦cnica seriada com instrumentos endodônticos, Endo-PTC e liquido de Dakin. Constitu¨ªram-se tr¨ºs grupos experimentais, Grupo C: Corante em sua forma liquida, Grupo E: Substância qu¨ªmica Endo PTC associada ao corante em sua formulação e Grupo C+E: Corante em sua forma liquida com irrigação final de liquido de Dakin em conjunto com Endo PTC por 15 min. A leitura de cor foi executada antes (L0), imediatamente ap¨®s o preparo qu¨ªmico-cirurgico (L1) e dez dias depois da irradiação (L2). Analise estat¨ªstica pelo teste de Wilcoxon comprovou que os resultados dos esp¨¦cimes do Grupo E nas interações L1-L2 e L0-L2 não acarretaram diferenças significativas. Pelos resultados obtidos foi poss¨ªvel concluir que: com base no projeto experimental que executou a t¨¦cnica endodôntica tradicional, todos os corantes ativadores testados, alteraram os valores de K. Na an¨¢lise comprobat¨®ria dos resultados de alteração crom¨¢tica pelos valores de K os melhores resultados foram observados nos esp¨¦cimes dos grupos Metileno E e Toluidina E que na interação L0-L1 não apresentaram diferenças estatisticamente significantes a 5%. / The present study had as objective to evaluate the dental staining after the root canal treatment when it¡¯s used the photodynamic therapy, using the dies methylene blue and orto toluidina blue as photosensitizers, through the RGB and K color system from the software Adobe Photoshop. Twenty human single root teeth had its roots canals prepared by the seriated technique using the endodontic instruments plus Endo-PTC and Dakin. Three experimental groups were formed: Group C: dye in its liquid form; Group E: dye associated to the Endo-PTC cream and Group CE: dye in its liquid form with final irrigation of the Dakin plus Endo¨CPTC for 15 minutes. The color measure was taken before (L0), immediately after (L1) and ten days after the laser irradiation. The statistical analysis performed using the Wilcoxon text proves that the results of the specimens of the E Group on the interactions L1-L2 and L0-L2 didn¡¯t have any significant differences. Based on the results obtained it was possible to conclude that: based on the experimental design that performed the traditional endodontic technique, all the activating dyes tested altered the values of K. After carrying out an analysis of the chromatic alteration results according to K values, the best results were observed in specimens of group methylene E and group toluidine E, both of which presented no statistically significant difference for the interaction L0-L1 (p ¡Ü 5%).