La co-culture d’amibes est utilisée afin d’isoler des microorganismes. Ainsi le premier virus géant,fut découvert. Cependant, les méthodes de culture sur protozoaires sont délicates et fastidieuses. De ce fait, le développement de ces cultures représente une difficulté pour les microbiologistes, limitant ainsi l’analyse d’un nombre important d’échantillons et la caractérisation de nouveaux virus. De nouvelles stratégies et des améliorations des modèles actuels sont donc nécessaires. Notre travail a été de développer de nouvelles stratégies permettant l’isolement de microorganismes associés aux amibes. Dans la 1ere partie nos travaux ont permis une amélioration des cultures avec le développement de nouveaux milieux de culture et l’utilisation ciblée d’antimicrobiens.La clé de ces stratégies est l’association des techniques rapides aux étapes améliorées de culture et leur application à un large panel de protozoaires pouvant abriter des microorganismes. Les résultats ont permis le développement d’un système d’isolement à haut débit très efficace. Nous avons notamment mis au point des techniques de tri de virus géants par cytométrie.Dans la seconde partie, nos travaux ont porté sur la description et la caractérisation des nouveaux isolats.Les résultats obtenus démontrent l’importance de poursuivre l’isolement et la caractérisation de ces microorganismes afin de mieux appréhender l’évolution de ces microorganismes, leur biotope et leur pathogénicité.De nouveaux outils sont nécessaires,notre manque d’imagination et l’absence de systèmes automatisés seront les limites aux nouvelles stratégies dans le monde de la microbiologie. / Amoebae are predators without distinction and they can also act as hosts to several different microorganisms that may coexist simultaneously. Some protozoa are sources of human pathogens where they act as reservoir of any human pathogens like Legionellae, Chlamydiaceae and others. In addition, the first giant virus, Acanthamoeba Polyphaga imivirus, was discovered using Amoeba as cell host. Since then, many other giant viruses have been isolated. For decades, amoebae were used as cell hosts in the culture- based process to isolate microorganisms, and allowed to recover new giant viruses and bacterial species from human and environmental samples. In contrast the co-culture system with protozoa is tedious and fastidious. Microbiologists are limited to routine culture methods, limiting by this the speed of screening potential samples and the efficiency of yielding new isolates. Much effort and improvement were needed. Our work consisted in the development of new strategies and techniques for the isolation of new microorganisms associated to protozoa. In the first part of this work, we described, all the improvements we brought to the protists culture system for the isolation of intracellular microorganisms especially giant viruses and Chlamydiaceae. Major improvements were based on modified culture enrichment steps, adapted culture media, and targeted use of specific drugs. The key of this new strategy was the implementation of high-throughput technologies to the ameliorated culture based systems, and the application of this later to a wide panel of protozoa used as potential host cells. These presented advances and strategies demonstrated significant time saving, and higher sensitivity than older techniques, they considerably increased the potential of collecting new environmental or clinical isolates and also new undiscovered microorganisms especially new giant virus familiesand particular Chlamydiaceae associated to amoebae. We continued to ameliorate the efficiency of the flow cytometric technology by reviewing its contributions to the virology field, then by applying it to the isolation system by sorting the new isolates as a new strategy for better genomic and proteomic analysis. In the second part of this work, we focused on the characterization of new isolates at the level of developmental cycle and genomic description. We used electron microscopy, and genome sequencing as main tools to describe our newly isolated giant viruses but also report new species of Chlamydiaceae and managed to decipher Chlamydiaceae species with a host dependent replication cycle, an issue that has not, thus far, been observed in protozoa-associated Chlamydiaceae. The strategies and results described herein show the importance of pursuing the isolation of new associatedamoebal microorganisms in order to give rise to new insights into the evolution of these microorganisms, their respective biotopes, and their potential or hidden pathogenicity. The more we need to search the more tools are needed, only our lack of imagination and appropriate automated systems will put limits on any needed strategy in the field of microbiology.

Les études d'association à grande échelle consistent à étudier la corrélation de plusieurs millions de polymorphismes nucléotidiques avec un risque de cancer chez des milliers d'individus, sans avoir besoin de connaissances préalables sur la fonction biologique de ces variants. Ces études ont été utiles pour établir des hypothèses étiologiques et comprendre l'architecture génétique sous-jacente de plusieurs maladies humaines. Cependant, la plupart des facteurs héréditaires de ces maladies restent inexpliqués. Une partie de cette variation pourrait venir de variants rares qui ne sont pas ciblés par les puces de génotypage actuelles ou encore de variants avec un effet plus modéré voire faible pour lesquels une détection par les études d'association actuelles n'est pas envisageable. Dans ce contexte et comme illustré dans cette thèse, les récentes études d'association peuvent maintenant servir de point de départ pour de nouvelles découvertes, en mettant en place des stratégies innovantes pour étudier à la fois les variants rares et les maladies rares. Nous avons plus particulièrement exploré ces techniques dans le cadre du cancer du poumon, des voies aérodigestives et du lymphome de Hodgkins. L'utilisation de la bioinformatique pour combiner les résultats des études avec d'autres sources d'information, l'intégration de différents types de données génomiques ainsi que l'investigation de la relation entre altérations germinales et somatiques représentent les principales opportunités poursuivies dans ce travail de thèse / Genome-wide association (GWA) studies consist in testing up to one million (or more) single nucleotide polymorphisms (SNPs) for their association with cancer risk in thousands of individuals, without requiring any prior knowledge on the functional significance of these variants. These studies have been valuable for establishing etiological hypotheses and understanding the underlying genetic architecture of human diseases. However, most of the heritable factors of these traits remain unexplained. Part of this variation may come from rarer variants that are not targeted by current genotyping arrays or variants with moderate to low effects for which detection by current GWA studies is impractical. In this context and as illustrated in this thesis, GWA studies can now serve as starting points towards further discoveries, looking for new strategies to study both rarer variants and rarer diseases. We have specifically explored these approaches in the context of lung cancer, head and neck cancer and Hodgkin's lymphoma. The use of bioinformatics to combine recent GWA study results with other sources of information, the integration of different types of genomic data as well as the investigation of the interrelationship between germline and somatic alterations represent the main opportunities pursued in this thesis work

La création de nouvelles enzymes pour l’hydrolyse de la biomasse est une stratégie clé pour ledéveloppement du bioraffinage. Dans ce contexte, les xylanases de la famille GH11 sont déjàdéployées dans de nombreux procédés industriels et donc bien positionnées pour jouer un rôleimportant dans ces procédés. La cible de cette étude, la xylanase GH11 (Tx-Xyl) de la bactérieThermobacillus xylanilyticus, est une enzyme thermostable et donc une bonne candidate pour destravaux d’ingénierie visant l’amélioration de son activité sur des substrats ligno-cellulosiques.Dans cette étude, deux stratégies d’ingénierie des enzymes ont été employées afin d’obtenir denouvelles informations portants sur les relations structure-fonction au sein de Tx-Xyl. La premièrestratégie a consisté en l’utilisation d’une approche de mutagenèse aléatoire, couplée à l’emploi deméthodes de recombinaison in vitro. Ces travaux avaient pour objectif d’améliorer la capacitéhydrolytique de Tx-Xyl sur la paille de blé. La deuxième stratégie mise en oeuvre s’est appuyée surune approche semi-rationnelle visant la création d’une enzyme chimérique, qui bénéficierait d’uneamélioration des interactions enzyme-substrat au niveau du sous-site -3.Le premier résultat majeur de cette thèse concerne le développement d’une méthode de criblagequi permet l’analyse à haut débit de banques de mutants pour la détection de variants quiprésentent une activité hydrolytique accrue directement sur paille de blé. A l’aide de ce crible, nousavons pu analyser plusieurs banques de mutants, représentant un total de six générations demutants, et identifier une série de combinaisons de mutations différentes. D’un côté, un variant,comportant deux mutations silencieuses, permet une meilleure expression de Tx-Xyl, alors qued’autres enzymes mutées présentent des modifications intrinsèques de leurs aptitudes catalytiques.Comparés à l’enzyme parentale Tx-Xyl, certains mutants solubilisent davantage les arabinoxylanes dela paille et, lorsqu’ils sont déployés avec un cocktail de cellulases, participent à une réactionsynergique qui permet un accroissement du rendement des pentoses et du glucose libérés.A l’aide d’une approche semi-rationnelle, une séquence de 17 acides aminés en provenance d’unexylanase GH11 fongique a été ajoutée à l’extrémité N-terminale de Tx-Xyl, afin de créer de nouveauxbrins β. L’enzyme chimérique a pu être exprimée avec succès et caractérisée. Néanmoins, l’analysede ses propriétés catalytiques a révélé que celle-ci ne présente pas davantage d’interactions avec sonsubstrat dans le sous-site -3, mais les résultats obtenus fournissent de nombreux renseignements surles relations structure-fonction au sein de l’enzyme. De plus, ces travaux nous permettent depostuler que Tx-Xyl posséderait un site de fixation secondaire pour les xylanes, un élement jusqu’iciinsoupçonné dans cette enzyme. Par ailleurs, l’analyse de nos résultats nous permet de proposer uneexplication rationnelle pour l’échec de notre stratégie initiale / Engineering new and powerful enzymes for biomass hydrolysis is one area that will facilitate thefuture development of biorefining. In this respect, xylanases from family GH11 are already importantindustrial biocatalysts that can contribute to 2nd generation biorefining. The target of this study, theGH11 xylanase (Tx-Xyl) from Thermobacillus xylanilyticus is thermostable, and is thus an interestingtarget for enzyme engineering, aiming at increasing its specific activity on lignocellulosic biomass,such as wheat straw. Nevertheless, the action of xylanases on complex biomass is not yet wellunderstood, and thus the use of a rational engineering approach is not really feasible.In this doctoral study, to gain new insight into structure-function relationships, two enzymeengineering strategies have been deployed. The first concerns the development of a randommutagenesis and in vitro DNA shuffling approach, which was used in order to improve the hydrolyticpotency of Tx-Xyl on wheat straw, while the second strategy consisted in the creation of a chimericenzyme, with the aim of probing and improving -3 subsite binding, and ultimately improvinghydrolytic activity.The first key results that has been obtained is the development of a novel high-throughputscreening method, which was devised in order to reliably pinpoint mutants that can better hydrolyzewheat straw. Using this screening method, several generations of mutant libraries have beenanalyzed and a series of improved enzyme variants have been identified. One mutant, bearing silentmutations, actually leads to higher gene expression, while others have intrinsically altered catalyticproperties. Testing of mutants has shown that some of the enzyme variants can improve thesolubilization of wheat straw arabinoxylans and can work in synergy with cellulose cocktails torelease both pentose sugars and glucose.Using a semi-rational approach, 17 amino acids have been added to the N-terminal of Tx-Xyl, withthe aim of adding two extra β-strands coming from a GH11 fungal xylanase. A chimeric enzyme hasbeen successfully expressed and purified and its catalytic properties have been investigated.Although this approach has failed to create increased -3 subsite binding, the data presented revealsimportant information on structure-function relationships and suggest that Tx-Xyl may possess ahitherto unknown secondary substrate binding site. Moreover, a rational explanation for the failureof the original strategy is proposed.

Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d’unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1→2) ; alpha (1→3) ; alpha (1→4) ou alpha (1→6)] que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d’élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d’un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1→6) et 5 % alpha (1→3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d’un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1→3) par rapport à l’enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d’identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l’aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentation / Glucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1→2); alpha (1→3); alpha (1→4) or alpha (1→6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1→6) and 5 % alpha (1→3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1→3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation.

Les échangeurs de chaleur constitués de microcanaux parallèles sont considérés une bonne solution technologique pour dissiper de grands flux de chaleur dans les composants et les systèmes miniaturisés. D’une manière générale cette réduction de taille permet une diminution des coûts des matériaux et l'utilisation de plus faible quantité de fluides frigorigènes pour les systèmes de refroidissement. Cette étude est divisée en deux parties complémentaires A et B. Elles visent à étudier le comportement thermo-hydraulique dans les échangeurs de chaleur constitués de microcanaux pour une meilleure compréhension des transferts de chaleur et des écoulements diphasiques dans les évaporateurs miniatures. Dans la partie A, nous étudions l'ébullition convective du réfrigérant R134a dans un mini échangeur composé de neuf microcanaux parallèles de section transversale circulaire, placés horizontalement, avec un diamètre interne de 0,77 mm et longueur et 150 mm. Les résultats expérimentaux montrent que la configuration d'écoulement a une forte influence sur le coefficient de transfert de chaleur, et que différents mécanismes de transfert de chaleur ont lieu dans chacune de ces configurations d'écoulement. En revanche la perte de pression est une fonction directe de la vitesse massique, du titre de vapeur et de la pression du système. La partie B, porte sur l’analyse de la distribution de l'écoulement diphasique en l’absence de transferts de chaleur et de changement de phase liquide-vapeur. A partir de ces résultats nous montrons que les effets du titre de gaz sur la répartition du liquide change considérablement selon la position de l'ensemble (tube d'alimentation, distributeur-canaux). / Heat exchangers consisting of parallel micro-channels are considered a good technological solution in response to the increasing demand for compact systems, which require high heat flux dissipation, ensuring a decrease in the material costs and the use of a lower quantity of refrigerants. The aim of this study was to investigate the thermo-hydraulic behavior inside these components provided by microchannels. This study is divided into two experimental studies (A and B) which are complementary. In part A, the convective boiling of the refrigerant R134a is analyzed within nine parallel microchannels of circular cross section, positioned horizontally, with internal diameter and length of 0.77 mm and 150 mm, respectively. The experimental results show that the flow pattern has a strong influence on the heat transfer coefficient, and that different heat transfer mechanisms are associated with each of the flow patterns observed, whereas the frictional pressure drop is a direct function of the mass velocity, vapor quality and pressure of the system. In part B, the two-phase flow distribution, using as the working fluid a mixture of air and water, is analyzed inside a circular header coupled to nine branched parallel microchannels of circular cross-section with internal diameter and length of 0.8 mm and 150 mm, respectively. The results show that the effect of the gas quality on the liquid distribution changes considerably depending on the configuration (feeder tube-header-channels).

L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de la présence d'obstacles dans les passes à poissons à fentes verticales. Deux types d'éléments sont couramment insérés, à l'heure actuelle, dans les passes : les seuils et les macro-rugosités. Dans un premier temps, l'effet de ces deux dispositifs à la fois sur l'écoulement et sur le comportement des poissons est étudié. Dans le but de favoriser le passage des petites espèces à travers le dispositif de franchissement, une solution technique est ensuite proposée, sous la forme de plusieurs rangées de cylindres flexibles placées en sortie de fente. La caractérisation du comportement hydraulique d'une passe à poissons équipée de ces obstacles est effectuée par des mesures expérimentales de niveau d'eau à l'aide de sondes acoustiques et des mesures de vitesses tridimensionnelles avec un vélocimètre acoustique à effet Doppler (ADV). La base de données générée par ces mesures est ensuite utilisée pour définir une loi de dimensionnement, qui prend en compte les paramètres influençant le fonctionnement hydraulique de l'ouvrage en vue d'améliorer sa conception. Les simulations numériques 3D instationnaires URANS et LES de l'écoulement permettent une analyse volumique fine des grandeurs caractéristiques de la turbulence qui règne dans les bassins en fonction du type d'obstacle inséré. En obstruant une partie de la fente, la présence d'un seuil accentue la tridimensionnalité de l'écoulement tandis que les macro-rugosités créent une zone de plus faible vitesses et des abris utilisables par les espèces de fonds. L'insertion des structures souples permet une meilleure dissipation de l'énergie du jet et réduit l'énergie cinétique turbulente dans une partie du volume des bassins. Les manipulations réalisées avec différentes espèces de poissons, permettent de mieux comprendre l'effet de la modification des grandeurs cinématiques de l'écoulement, par l'insertion d'obstacles, sur le comportement des poissons pour pouvoir adapter les passes à poissons existantes aux espèces dotées de faibles capacités de nage. / The aim of this work is to characterize the influence of two kinds of obstacles, sills and macro-roughnesses, on the flow inside a vertical slot fishway (VSF) and the behavior of several species of fish. Another objective is to study a technical solution to allow the passage of small fish species, which take the form of flexible cylinders placed in the jet at the entrance of each pool of the VSF. A hydraulic characterization is made by experimental measurements of the water level in each pool with acoustic sensors and by measurements of three-dimensional velocity components with an acoustic Doppler velocimeter (ADV). The data acquired by these measurements are then used to define a predictive law that takes into account the presence of sills or macro-roughnesses, to help the design of devices that are as efficient as possible. Unsteady RANS and LES three-dimensional numerical simulations of the flow allow performing a careful volume analysis of the turbulence characteristics inside the pools when obstacles are presents in the flow. By obstructing a part of the slot, sills enhance the three-dimensionality of the flow while macro-roughnesses generate a low velocity layer and shelters for benthic species. Flexible elements produce a better dissipation of the energy of the jet and reduce the turbulent kinetic energy in a part of the volume of the pools. The effect of the modification of the flow kinematic properties, by the presence of obstacles, on the behavior of various fish species is evaluated. It provides important insights on how to adapt the flow in existing fishways to fish species with low swimming capacity.

L'utilisation d'organismes génétiques modèles a permis l'investigation à grande échelle de mécanismes cellulaires et moléculaires pour la biologie. La larve de poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme vertébré modèle simple qui présente plusieurs avantages pour identifier les bases moléculaires et pharmacologiques du développement et du comportement à travers des cribles génétiques et chimiques respectivement. Plusieurs paradigmes expérimentaux reposent sur une caractérisation précise du phénotype comportemental associé avec un génotype ou l’application d’une drogue. Ce processus de phénotypage bénéficierait d'une compréhension globale des manœuvres possibles afin de caractériser précisément le comportement globale de larves observé au cours d'une expérience. L'analyse sur plusieurs minutes de la locomotion spontanée des larves de poisson zèbre en groupe fournit un cadre idéal pour atteindre ces objectifs.Si l'analyse manuelle du comportement animal est possible pour l'observation de manœuvres isolées et stéréotypées, elle n’est pas compatible avec une approche à grande échelle. A partir de cinq jours, la larve de poisson zèbre se meut sous forme de bouffées natatoires qui arrivent à haute fréquence et sont séparées par quelques secondes. La difficulté d'observation à haute fréquence et d'analyse de la locomotion en bouffée rend une analyse manuelle simple à partir de séquences vidéos du comportement impossible. Le développement récent de caméras rapides avec acquisition en mode continu, couplé aux avancées en informatique et en intelligence artificielle rend possible une analyse automatique du comportement. Les systèmes commerciaux actuels permettent des enregistrements sur des longues durées mais sans capturer la complexité et la diversité des mouvements réalisés. Nous avons donc créé ZebraZoom, notre système d'analyse haut débit permettant de suivre, de quantifier et de catégoriser le comportement spontané de chaque larve de poisson zèbre au sein d’un groupe.Nous avons monté un dispositif expérimental qui consiste à placer sept larves de poisson zèbre âgées d'entre cinq et sept jours dans huit boîtes de pétri. Les boîtes de pétri sont disposées sur une table lumineuse et une caméra rapide positionnée au-dessus enregistre le comportement spontané à 337 Hz pendant quatre minutes. Une fois la vidéo acquise, ZebraZoom localise automatiquement chacune des huit boîtes de pétri, puis suit tête et queue de chacun des animaux sur l'ensemble de la vidéo, grâce à des procédures de vision par ordinateur. ZebraZoom identifie automatiquement chaque bouffée natatoire. Le phénotypage du comportement a été réalisé grâce à deux méthodes complémentaires : l'extraction de paramètres globaux caractérisant la dynamique des mouvements et la catégorisation automatique des mouvements en différents manœuvres stéréotypées. Nous avons utilisé l’analyse des paramètres globaux afin de caractériser l'effet de drogues agissant sur les récepteurs de neurotransmetteurs et l’analyse d’un mutant aveugle. La catégorisation automatique des mouvements est réalisée grâce a des procédures d’apprentissage automatique (« Machine Learning »). Nous avons illustré l’utilité de cette catégorisation pour étudier les interactions entre larves à ces stades précoces. En conclusion, notre programme ZebraZoom permet de réaliser un phénotypage automatique et complet, et cette approche pourra être appliquée dans d'autres systèmes et contextes expérimentaux. / The use of simple genetic model organisms has allowed large-scale investigation of cellular and molecular mechanisms in biology. The zebrafish larva (Danio rerio) is a simple vertebrate model with several advantages for the identification of the molecular and pharmacological basis of development and behavior thanks to genetic and chemical screens. Several experimental paradigms rely on a precise behavioral characterization associated with a genotype or a drug application. This phenotyping process would benefit from a global comprehension of all possible zebrafish larvae maneuvers in order to precisely characterize the global behavior of larvae observed during an experiment. The analysis over multiple minutes of the spontaneous locomotion of zebrafish larvae in a group provides an ideal framework for achieving these goals.The manual analysis of animal behavior is possible for the observation of stereotyped and isolated maneuvers, but it is not compatible with large-scale approaches. After five days, the zebrafish larva moves in burst of movement occurring at high frequency and separated by a few seconds. The difficulty of observation of high-frequency maneuvers makes a manual analysis of videos impossible. The recent development of high-speed cameras, coupled with advances in computer science and artificial intelligence, make an automatic analysis of behavior possible. The available commercial solutions allow long acquisitions but without capturing all the complexity and diversity of the movements. We thus created ZebraZoom, our high-throughput analysis system which makes it possible to follow, quantify and categorize the spontaneous behavior of all zebrafish larva in a group.We built an experimental setup which consisted in placing seven 5- to 7-day old zebrafish larvae in eight petri dishes. The petri dishes were placed on a light table and a high-speed camera was placed above the setup and allowed to record the spontaneous behavior at 337 Hz during four minutes. Once the video was acquired, ZebraZoom localized automatically each of the eight petri dishes and followed the head and the tail of each of the animals on the entire video, thanks to computer vision methods. ZebraZoom then identifies automatically all burst of movement.The behavior phenotyping was performed thanks to two complementary methods: the extraction of global parameters characterizing movement dynamics and the automatic categorization of movements into stereotyped maneuvers. We used global parameters analysis to characterize the effect of drugs acting on neurotransmitters receptors and to analyze the behavior of a blind mutant. The automatic categorization of movements was carried out thanks to machine learning procedures. We showed the utility of this categorization method in studying interactions between larvae at early stages. In conclusion, our ZebraZoom program makes it possible to carry out an automatic and complete phenotyping, and this approach could be used in other systems and experimental contexts.

Le système immunitaire adaptatif joue un rôle de premier plan dans la défense contre les infections. La réponse humorale, impliquant la production d'anticorps, est un élément important de la réponse immunitaire adaptative. Au cours d'une infection, des cellules B spécifiques du système immunitaire prolifèrent et libèrent de grandes quantités d'anticorps qui se lient sélectivement à la protéine cible (antigène) trouvée sur le pathogène invasif, induisant la destruction du pathogène.Cependant, le système immunitaire ne répond pas toujours suffisamment efficacement pour détruire les agents pathogènes, et les mécanismes de tolérance empêchent la génération d'anticorps contre les protéines humaines - comme les marqueurs de surface cellulaire sur les cellules cancéreuses ou les cytokines impliquées dans des maladies inflammatoires et auto-immunes - qui pourraient être des cibles thérapeutiques importantes. Par conséquent, il existe un grand intérêt pour la recherche et le développement d'anticorps spécifiques qui peuvent être utilisés pour le traitement des patients par immunothérapie. En raison de leur grande affinité et de leur liaison sélective aux antigènes, les anticorps monoclonaux (mAbs) sont apparus comme des agents thérapeutiques puissants. Les anticorps monoclonaux dérivés de cellules B individuelles ont une séquence unique et présentent une affinité de liaison pour un antigène spécifique. Cependant, jusqu'à maintenant, la découverte des mAbs a été limitée par l'absence de méthodes à haut débit pour le criblage direct et à grande échelle de cellules B primaires non immortalisées pour découvrir les rares cellules B qui produisent des anticorps spécifiques d'intérêt clinique. Ceci est maintenant possible avec l'émergence et l'amélioration des méthodes de compartimentation in vitro pour l'encapsulation et le criblage de cellules uniques dans des gouttelettes picolitriques. Dans mon projet de doctorat, je décris le développement d'immunodosages et de dispositifs microfluidiques pour le criblage phénotypique direct de cellules individuelles à partir de populations de cellules B enrichies. Ce développement a permis une analyse détaillée de la réponse immunitaire humorale, avec une résolution à l’échelle de la cellule unique. C’est aussi un élément essentiel d'un pipeline de détection d'anticorps couplant le criblage phénotypique de cellules individuelles au séquençage d'anticorps sur cellules uniques. Il est maintenant possible, pour la première fois, de cribler des millions de cellules B individuelles en fonction de l'activité de liaison des anticorps sécrétés et de récupérer les séquences d'anticorps / The adaptive immune system plays a leading role in defense against infection. The humoral response, involving the production of antibodies, is an important component of the adaptive immune response. During an infection, specific B cells of the immune system proliferate and release large amounts of antibodies which bind selectively to the target protein (antigen) found on the invading pathogen, inducing destruction of the pathogen. However, the immune system does not always respond efficiently enough to destroy pathogens, and tolerance mechanisms prevent the generation of antibodies against human protein - such as cell surface markers on cancer cells or cytokines involved in inflammatory and autoimmune disease - that could be important therapeutic targets. Hence, there is great interest in research and development of specific antibodies that can be used for immunotherapy of patients. Due to their high affinity and selective binding to antigens, monoclonal antibodies (mAbs) have emerged as powerful therapeutic agents. Monoclonal antibodies derived from single B cells have a unique sequence and display binding affinity for a specific antigen. However, until now, the discovery of mAbs has been limited by the lack of high-throughput methods for the direct and large-scale screening of non-immortalized primary B cells to uncover rare B cells which produce the specific antibodies of clinical interest. This is now becoming possible with the emergence and improvement of in vitro compartmentalization methods for single-cell encapsulation and screening in picoliter droplets. In my PhD project, I describe the development of binding immunoassays and microfluidic devices for the direct phenotypic screening of single-cells from enriched B cell populations. This development has enabled detailed analysis of the humoral immune response, with single-cell resolution and is an essential component of an antibody-discovery pipeline coupling single-cell phenotypic screening to single-cell antibody sequencing. It is now possible, for the first time, to screen millions of single B cells based on the binding activity of the secreted antibodies and to recover the antibody sequences

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Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène important, entrainant des pertes économiques de 130 millions de dollars annuellement au Canada. La surveillance est effectuée par séquençage Sanger du gène ORF5 mais nous croyons que le séquençage du génome entier (SGE) du VSRRP permettrait une meilleure surveillance épidémiologique comparé au séquençage du gène ORF5. Pour développer une méthode efficace de SGE du VSRRP, 149 échantillons (sérums, poumons, tissus, autres) d’animaux malades ou récoltés pour fin de surveillance ont été analysés. L'ARN viral a été concentré par enrichissement d'ARN à queue poly (A) et le séquençage effectué sur une plateforme Illumina. Le SGE a été efficace dans 67,11% des échantillons, réussissant dans certains échantillons de poumons et de sérums possédant une valeur de quantification (Cq) du virus par RTqPCR jusqu’à 26,50 et 34.13, respectivement. La méthodologie développée de SGE du VSRRP a été 4650 fois plus sensible que les méthodes décrites précédemment. Pour quantifier l’impact du SGE, 88 échantillons (dont le SGE a réussi) ont été utilisés pour comparer le SGE au séquençageORF5. Deux génomes de VSRRP différents ont été trouvés dans quatre échantillons différents (taux de coinfection de 4,55%). Six génomes de VSRRP (6,52% des souches) ont été classés différemment par rapport à la classification ORF5. Ainsi, le SGE du VSRRP a permis une meilleure caractérisation de 9,10% des échantillons VSRRP positifs comparé au séquençage ORF5. Donc, le SGE du VSRRP est à la fois sensible et plus précis que la classification par l’ORF5. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an important pathogen, costing over 130 million dollars annually in Canada. Surveillance is done by Sanger sequencing of the ORF5 gene, but we hypothesized that whole genome sequencing (WGS) of PRRSV genome will allow a better epidemiological monitoring of PRRSV compared to ORF5 gene sequencing. To develop an efficient method of PRRSV WGS, 149 PRRSV samples (sera, lungs, pool of tissues and others) collected for surveillance or from sick animals were tested. Viral RNA was concentrated using a poly(A) tailed RNA enrichment method, and sequencing was done on an Illumina platform. WGS was successful in 67.11% of cases. WGS was successful in some tissues and lungs samples with RT-qPCR cycle quantification (Cq) values up to 26.50, and in some sera with Cq value up to 34.13. The developed WGS methodology was 4650 times more sensitive for PRRSV WGS than previously described methods. To quantify the impact of WGS, 88 successful samples for the WGS of PRRSV were used to compare efficiency of WGS and ORF5 sequencing. Two different full-length genomes of PRRSV were found in four of those samples (coinfection rate of 4.55%). Six full-length PRRSV genomes (6.52% of PRRSV strains) were found to cluster differently compared to ORF5 sequencing. WGS of PRRSV also enabled a better classification or characterisation of 9.10% of the PRRSV infected samples compared to ORF5 sequencing. Thus, WGS can be both sensitive and more accurate then ORF5 classification for the characterisation of PRRSV strains.