MARTINS, M.G.Q. Biodegradação de ácido 2,4 - Diclorofenoxiacético por burkholderia sp. 2012. 113 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-26T20:18:20Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-26T20:18:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-26T20:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mgqmartins.pdf: 2492565 bytes, checksum: 3b6832f0ed7442ae5b935515c41bb4af (MD5) Previous issue date: 2012 / Bacteria of the genus Burkholderia have the capacity to degrade various toxic and recalcitrant compounds. Based on the foregoing, this study used real-time PCR (qRT-PCR) and two-dimensional electrophoresis (2DE) to investigate the gene expression profiles tfdB related to biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and differentially expressed proteins qualitative and qualitative, respectively in the presence of 2,4-D Burkholderia sp. SMF07. In order to make the extraction of RNA and protein total bacterial growth was carried out in two TY culture media (Tryptone-Yeast Medium), a control and the other being supplemented with 1 mg / mL 2,4-D, both were incubated at 28 ° C. RNA extraction and total proteins was done after addition of the pollutant in time of 15 minutes, 1, 2, 3 and 5 hours and during the log phase bacterial growth, respectively. The quality of total RNA was measured by the integrity of the fragments of ribosomal RNA (rRNA) checked by electrophoresis on 1.2% agarose gel and the ratio between the absorbances at 260 nm and 280 nm. For quantitative and qualitative analysis of proteins, the method of Bradford and SDS-PAGE, respectively. The synthesis of complementary DNA (cDNA) was determined from the total RNA using the enzyme reverse transcriptase (Superscript III, Invitrogen) using random primers and 6-mer (Invitrogen). Relative expression of the gene was performed using tfdB qRT Power-PCR using SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) and using the 16S rRNA gene as housekeeping. The synthesized cDNA was used as template DNA. Comparative analysis of qRT-PCR was performed by 2-ΔΔCT method. The total proteins extracted from the two-dimensional map was determined for each reference condition. The adjustment of the two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots and evaluate data to determine quantitative and qualitative variations, molecular mass (MM) and isoelectric point (pI) of the spots was done by the program ImageMaster®. Proteins differentially expressed quantitatively and qualitatively in the presence of 2,4-D were identified using the values of pI and MM of the spot against a database of proteins available in UniProt ExPASy server. According to this work, the gene expression tfdB significantly increased 200% over the control after one hour of induction of the abovementioned herbicides. The mean number of spots of replication of protein was 836 2DE gel (control) and 803 (treatment). The greater abundance of proteins was observed in the 2DE gels in pH range 5-6 with MM between 20 and 40 quilodalton (kDa). It was verified in 2DE gels differentially expressed proteins quantitatively and qualitatively to the stress condition in response to bacterial 2,4-D compared to control. Most of these identified proteins belong to molecular function: hydrolase or transferase, expressed different quantitative and qualitative. For these reasons, the strain of Burkholderia sp. SMF07 introduced tfdB also the gene expression level was increased and it was possible to detect differentially expressed proteins qualitatively and quantitatively to grow in medium containing 2,4-D, indicating the importance of these bacteria on the biodegradation of the pollutant. In accordance with these data, we conclude that strain Burkholderia sp. SMF07 tfdB introduced gene, which demonstrated high expression in a medium containing 2,4-D. Adicionadamente, were differentially expressed proteins in medium supplemented above, indicating the importance of these bacteria as a biotechnological tool for the biodegradation potential of this pollutant / Bactérias do gênero Burkholderia apresentam capacidade de degradar diversos compostos tóxicos e recalcitrantes. Com base no exposto, neste estudo foi utilizado PCR em tempo real (qRT-PCR) e eletroforese bidimensional (2DE) para investigar os perfis de expressão do gene tfdB relacionado a biodegradação de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e proteínas diferencialmente expressas qualitativa e qualitativa, respectivamente na presença de 2,4-D por Burkholderia sp. SMF07. A fim de fazer a extração de RNA e proteínas totais foi realizado o crescimento bacteriano em dois meios de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), sendo um controle e o outro suplementado com 1 mg/mL de 2,4-D, ambos foram incubados a 28 ºC. A extração de RNA e proteínas totais foi feita após a adição do poluente no tempo de 15 minutos, 1, 2, 3 e 5 horas e durante a fase log do crescimento bacteriano, respectivamente. A qualidade do RNA total foi mensurada pela integridade dos fragmentos de RNA ribossômico (rRNA) verificado por eletroforese em gel de agarose 1,2% e pela relação entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm. Para análise quantitativa e qualitativa das proteínas foi utilizado o método de Bradford e SDS-PAGE, respectivamente. A síntese do DNA complementar (cDNA) foi realizada a partir do RNA total extraído utilizando a enzima de transcrição reversa (Superscript III, Invitrogen) e empregando iniciadores randômicos 6-mer (Invitrogen). A expressão relativa do gene tfdB foi feita através qRT-PCR utilizando Power SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems) e empregando o gene 16S rRNA como housekeeping. O cDNA sintetizado foi empregado como DNA template. A análise comparativa da qRT-PCR foi feita pelo método 2-ΔΔCT. A partir das proteínas totais extraídas foi determinado o mapa bidimensional de referência para cada condição. O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação de variações quantitativas e qualitativas, massa molecular (MM) e ponto isoelétrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster®. Proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente na presença de 2,4-D foram identificadas utilizando os valores de pI e MM do spot contra um banco de dados de proteínas UniProt disponível no servidor ExPASy. De acordo com esse trabalho, a expressão do gene tfdB aumentou significativamente 200% em relação ao controle após 1 hora de indução com o supracitado herbicida. O número médio de spots protéicos das replicas dos géis 2DE foi de 836 (controle) e 803 (tratamento). A maior abundância de proteínas foi observada nos géis 2DE na faixa de pH de 5-6 com MM entre 20 e 40 quilodalton (kDa). Foi possível verificar nos géis 2DE proteínas diferencialmente expressas quantitativamente e qualitativamente para a condição de estresse bacteriano em reposta ao 2,4-D em relação ao controle. A maioria dessas proteínas identificadas pertence às funções moleculares: transferase ou hidrolase, diferentes expressas quantitativas e qualitativas. De acordo com os presentes dados, conclui-se que a cepa de Burkholderia sp. SMF07 apresenta o gene tfdB, o qual demostrou seu nível de expressão aumentado em meio contendo 2,4-D. Adicionadamente, houve proteínas diferencialmente expressas no referido meio suplementado, indicando a importância desta bactéria como ferramenta biotecnológica potencial para a biodegradação deste poluente.

Inspired by natural catalytic systems, metalloporphyrins and Salen complexes have been used as catalysts for the oxidation of xenobiotics in the presence of several oxygen donors, both in homogeneous and heterogeneous catalysis. These catalysts have been highly efficient and selective in the reactions of different substrates, such as pharmaceuticals and pesticides. In this context, the work developed in this dissertation presents the oxidation studies of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide using ferroporphyrins and Jacobsen catalyst as catalysts of these reactions with several oxygen donors. The results shows that the metalloporphyrin and the complex employed in this study are efficient catalysts for oxidation of 2,4-D in the presence of oxygen donors iodosilbenzene (PhIO), metachloroperbenzoic acid (m-CPBA) and hydrogen peroxide (H2O2) both in homogeneous and heterogeneous. The reactions with the unsupported catalysts achieved higher yields than those obtained with the supported catalysts, which is possibly related to the difficulties of access to the catalytic center imposed by the support. The conversion of 2,4-D reached more than 50% in some systems, and, in general, oxidation reactions with the three oxygen donors were selective promoting the formation of hydroquinone (reactions with PhIO and H2O2) and 3,5- dichlorocatechol (reactions with m-CPBA). One of the products identified in the reactions is a metabolite of 2,4-D produced in vivo systems, indicating that the catalysts used in this study can be considered good models of cytochrome P450 in the oxidation of 2,4-D. / Inspirados em sistemas catalíticos naturais, metaloporfirinas e complexos salen têm sido utilizados como catalisadores para a oxidação de xenobióticos na presença de diversos doadores de oxigênio, tanto em catálise homogênea quanto heterogênea. Esses catalisadores têm se mostrado altamente eficientes e seletivos nas reações de diferentes substratos, tais como fármacos e pesticidas. Dentro desse contexto, o trabalho desenvolvido nessa dissertação apresenta os estudos da oxidação do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) utilizando ferroporfirinas e catalisador de Jacobsen como catalisadores dessas reações com diversos doadores de oxigênio. Os resultados mostram que a metaloporfirina e o complexo salen empregados nesse estudo são eficientes catalisadores para a oxidação do 2,4-D na presença dos doadores de oxigênio iodosilbenzeno (PhIO), ácido metacloroperbenzóico (m-CPBA) e peróxido de hidrogênio (H2O2), tanto em meio homogêneo como heterogêneo. As reações com os catalisadores não suportados alcançaram rendimentos mais altos do que os obtidos com os catalisadores suportados, o que está possivelmente relacionado as dificuldades de acesso ao centro catalítico imposta pelo suporte. A conversão de 2,4-D atingiu mais de 50% em alguns sistemas, e, em geral, as reações de oxidação com os três doadores de oxigênio foram seletivas promovendo a formação de hidroquinona (reações com PhIO e H2O2) e 3,5-diclorocatecol (reações com m-CPBA). Um dos produtos identificados nas reações é um metabólito do 2,4-D produzido sistemas in vivo, indicando que os catalisadores utilizados nesse estudo podem ser considerados bons modelos do citocromo P450 na oxidação do 2,4-D.