Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

Este trabalho consistiu de estudos da viabilidade da geração e identificação de radicais livres envolvidos em processos oxidativos avançados por via eletroquímica. Para a geração e identificação de radicais livres em eletrodos modificados com organotióis via eletroquímica, escolheu-se uma técnica pouco aplicada para este fim; a espectroscopia de impedância eletroquímica, e o ajuste dos dados experimentais pela proposta de modelos de circuitos equivalentes. O eletrodo de trabalho utilizado (Au) foi caracterizado em meio ácido e básico e diversas monocamadas auto-organizadas conhecidas foram adsorvidas sobre o mesmo e também caracterizadas por esta técnica. Parâmetros importantes como constante dielétrica, capacitância de uma monocamada livre de defeitos e grau de recobrimento foram determinados com êxito. Também foram empregadas moléculas menos utilizadas como modificadoras de eletrodos (fenotiazinas e derivados). As mesmas foram caracterizadas no sistema Au/adsorvente/NaOH, pois, o pH alto garante a formação do radical superóxido e do ânion hidroperóxido. Os mesmos modelos de circuitos equivalentes puderam ser empregados na obtenção dos parâmetros físicos relativos a essas moléculas no sistema eletroquímico utilizado. Em uma etapa subsequente obteve-se a valiosa informação, se as moléculas adsorvidas sobre Au poderiam ser usadas para a geração de superóxido e outros radicais. As monocamadas de tióis, quando utilizadas para gerar radicais livres, se mostraram aptas a gerar superóxido em meio alcalino saturado com oxigênio molecular. Como se demonstrou na etapa de caracterização, as SAM-3 e SAM-6 não formaram um empacotamento totalmente hidrofóbico. Por este motivo, mesmo que superóxido tenha sido gerado, não pôde ser detectado. Já para a fenotiazina e seu metil-derivado, a cinética de adsorção e a utilização de soluções aquosas impediram a formação de um filme completo e homogêneo, imprescindível para a constituição de uma interface hidrofóbica e isolante. Além disso, possíveis reações de complexação entre as moléculas e superóxido, reações entre a fenotiazina cátion-radical e superóxido fazem necessários mais estudos acerca da natureza eletroquímica do sistema, que já é bastante conhecido fotoquimicamente. Posterior a modificação, todos os eletrodos se mostraram ser bastante sensíveis ao pH e aos eletrólitos utlizados, alterando-se a estrutura interna muito facilmente, o qual implica uma limitação no tempo de uso e reprodutibilidade quando da geração de um radical tão reativo quanto superóxido. / This work consisted in testing the viability of investigations into the electrochemical generation and identification of free radicals involved in advanced oxidative processes. In these studies, a technique which is rarely used for the electrochemical generation and identification of free radicals at organothiole-modified electrodes, electrochemical impedancy spectroscopy, was chosen and the experimental data obtained were fitted by equivalent circuit models. A working electrode (Au) was characterized in both acidic and basic media and several known self-assembled monolayers were adsorbed over this electrode and also characterized using this technique. Important parameters such as dielectric constants, capacitance of the monolayers free of defects and coverage were determined with success. Other lesser-known molecules such as phenothiazines and their derivatives were also used .The modified electrodes were characterized in NaOH solution, since the high pH assures the production of superoxide radicals and hydroperoxylate anions. The equivalent circuit model was employed to obtain physical parameters for these molecules in the electrochemical systems studied. In a subsequent step, a valuable piece of information was obtained; it was noted that the molecules adsorbed over Au could be used in order to generate superoxide and other radicals. The ability of thiol monolayers used in the generation of free radicals, to produce superoxides in alkaline media saturated with molecular oxygen was demonstrated. However, characterization of the self-assembled monolayers, SAM-3 and SAM-6, revealed that these were not able to pack in a completely hydrophobic manner. This may account for the fact that the superoxide could not be detected even when it was believed to have formed. For the phenothiazine-modified electrodes, the adsorption kinetics and the utilization of aqueous solutions prevented the formation of an intact and homogeneous film, which is essential in establishing a hydrophobic and isolating interface. Furthermore, possible complexation reactions between the molecules and the superoxide and reactions between the phenothiazine cation-radical and superoxide, point to the need for further studies regarding the electrochemical nature of this system, whose photochemical properties are very well known. Following modification, all the electrodes were shown to be too sensitive to pH and to the electrolytes used, since the inner structure was easily modified, which implies that they would have a limited time of use and in addition that the reproducibility of the rate of generation of reactive radical species such as superoxides could be compromised.

Este trabalho consistiu de estudos da viabilidade da geração e identificação de radicais livres envolvidos em processos oxidativos avançados por via eletroquímica. Para a geração e identificação de radicais livres em eletrodos modificados com organotióis via eletroquímica, escolheu-se uma técnica pouco aplicada para este fim; a espectroscopia de impedância eletroquímica, e o ajuste dos dados experimentais pela proposta de modelos de circuitos equivalentes. O eletrodo de trabalho utilizado (Au) foi caracterizado em meio ácido e básico e diversas monocamadas auto-organizadas conhecidas foram adsorvidas sobre o mesmo e também caracterizadas por esta técnica. Parâmetros importantes como constante dielétrica, capacitância de uma monocamada livre de defeitos e grau de recobrimento foram determinados com êxito. Também foram empregadas moléculas menos utilizadas como modificadoras de eletrodos (fenotiazinas e derivados). As mesmas foram caracterizadas no sistema Au/adsorvente/NaOH, pois, o pH alto garante a formação do radical superóxido e do ânion hidroperóxido. Os mesmos modelos de circuitos equivalentes puderam ser empregados na obtenção dos parâmetros físicos relativos a essas moléculas no sistema eletroquímico utilizado. Em uma etapa subsequente obteve-se a valiosa informação, se as moléculas adsorvidas sobre Au poderiam ser usadas para a geração de superóxido e outros radicais. As monocamadas de tióis, quando utilizadas para gerar radicais livres, se mostraram aptas a gerar superóxido em meio alcalino saturado com oxigênio molecular. Como se demonstrou na etapa de caracterização, as SAM-3 e SAM-6 não formaram um empacotamento totalmente hidrofóbico. Por este motivo, mesmo que superóxido tenha sido gerado, não pôde ser detectado. Já para a fenotiazina e seu metil-derivado, a cinética de adsorção e a utilização de soluções aquosas impediram a formação de um filme completo e homogêneo, imprescindível para a constituição de uma interface hidrofóbica e isolante. Além disso, possíveis reações de complexação entre as moléculas e superóxido, reações entre a fenotiazina cátion-radical e superóxido fazem necessários mais estudos acerca da natureza eletroquímica do sistema, que já é bastante conhecido fotoquimicamente. Posterior a modificação, todos os eletrodos se mostraram ser bastante sensíveis ao pH e aos eletrólitos utlizados, alterando-se a estrutura interna muito facilmente, o qual implica uma limitação no tempo de uso e reprodutibilidade quando da geração de um radical tão reativo quanto superóxido. / This work consisted in testing the viability of investigations into the electrochemical generation and identification of free radicals involved in advanced oxidative processes. In these studies, a technique which is rarely used for the electrochemical generation and identification of free radicals at organothiole-modified electrodes, electrochemical impedancy spectroscopy, was chosen and the experimental data obtained were fitted by equivalent circuit models. A working electrode (Au) was characterized in both acidic and basic media and several known self-assembled monolayers were adsorbed over this electrode and also characterized using this technique. Important parameters such as dielectric constants, capacitance of the monolayers free of defects and coverage were determined with success. Other lesser-known molecules such as phenothiazines and their derivatives were also used .The modified electrodes were characterized in NaOH solution, since the high pH assures the production of superoxide radicals and hydroperoxylate anions. The equivalent circuit model was employed to obtain physical parameters for these molecules in the electrochemical systems studied. In a subsequent step, a valuable piece of information was obtained; it was noted that the molecules adsorbed over Au could be used in order to generate superoxide and other radicals. The ability of thiol monolayers used in the generation of free radicals, to produce superoxides in alkaline media saturated with molecular oxygen was demonstrated. However, characterization of the self-assembled monolayers, SAM-3 and SAM-6, revealed that these were not able to pack in a completely hydrophobic manner. This may account for the fact that the superoxide could not be detected even when it was believed to have formed. For the phenothiazine-modified electrodes, the adsorption kinetics and the utilization of aqueous solutions prevented the formation of an intact and homogeneous film, which is essential in establishing a hydrophobic and isolating interface. Furthermore, possible complexation reactions between the molecules and the superoxide and reactions between the phenothiazine cation-radical and superoxide, point to the need for further studies regarding the electrochemical nature of this system, whose photochemical properties are very well known. Following modification, all the electrodes were shown to be too sensitive to pH and to the electrolytes used, since the inner structure was easily modified, which implies that they would have a limited time of use and in addition that the reproducibility of the rate of generation of reactive radical species such as superoxides could be compromised.

Os mecanismos oxidativos pelos quais macrófagos exercem atividade microbicida permanecem em discussão, e estudos com hospedeiros animais serão essenciais para elucidar tal questão. Nesse trabalho, estudamos os mecanismos microbicidas de macrófagos in vivo comparando parâmetros de infecção nas lesões de camundongos resistentes (C57Bl/6) e suscetíveis (BALB/c) ao protozoário Leishmania amazonensis. A comparação mostrou que o controle da infecção pelos camundongos resistentes é dependente da ativação de macrófagos com expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível, síntese de óxido nítrico e extensa nitração e hidroxilação das proteínas dos parasitas dentro dos fagolisossomos dos macrófagos. O principal agente tóxico aos parasitas parece ser derivado do peroxinitrito porque a nitração dos parasitas ocorreu na ausência virtual de células polimorfonucleares e foi acompanhada de hidroxilação. Além disso, tempol um inibidor de reações de nitração mediadas por peroxinitrito, inibiu a nitração de proteínas da lesão e aumentou o número de parasitas nelas presentes. Também, estudos com parasitas em cultura confirmaram que o peroxinitrito é citotóxico aos parasitas enquanto o óxido nítrico é citostático. O camundongo suscetível se mostrou capaz de sintetizar óxido nítrico mas o fez em estágios tardios da infecção e, provavelmente, em resposta a uma infecção secundária por bactérias. Tomados conjuntamente, os resultados indicam que o peroxinitrito e radicais dele derivados são os principais agentes leishmanicidas produzidos por macrófagos in vivo. / Macrophage oxidative microbicidal mechanisms remain debatable and their elucidation is likely to depend on studies with mammalian hosts. To examine macrophage microbicidal mechanisms in vivo, we compared infection parameters in the lesions of resistant (C57Bl/6) and susceptible (BALB/c) mice to the protozoan Leishmania amazonensis. This comparison demonstrated that infection control by resistant mice relied on macrophage activation with inducible nitric oxide synthase expression, nitric oxide synthesis and extensive nitration and hydroxylation of the proteins of the parasites inside macrophage phagolysosomes. The toxic agent to the parasite is likely to be peroxynitrite-derived because parasite nitration occurred in the virtual absence of polymorphonuclear cells and was accompanied by parasite hydroxylation. In addition, tempol, an inhibitor of peroxynitrite-mediated nitrations, inhibited protein nitration of the lesions and increased the number of parasites in them. Also, studies with parasite cultures confmed that peroxynitrite is cytotoxic to the parasites whereas nitric oxide is cytostatic. The susceptible mice were also able to synthesize nitric oxide but only at late infection time and, most likely, in response to a secondary bacterial infection. Taken together, the results indicate that peroxynitrite and derived radicals are the main leishrnanicidal agents produced by macrophages in vivo.

Economically advantageous alternatives to fully explore the antioxidant content of tropical fruit residues from juice processor industries have been currently studied in the State of Alagoas, Brazil. Thus, flour methanolic extracts of acerola (AC), passion fruit (PF) and pineapple (PA) residues were screened for their antioxidant capacity. For this, their total phenolic content, antioxidant capacity toward DPPH and toward the superoxide anion radical, together with analysis of their protective effect against membrane lipid peroxidation, caused by peroxyl radical, were determined in the flour methanolic extracts. In the last case, the phospholipid bilayer biomimetic model with the inclusion of a fluorescent probe was used. The statistical analysis employed the epi info version 6.04d (2001) program and Microsoft excel, using the test t, multivaried analysis and qui-square, considering p < 0.05 as significant. The results of total phenolic content of flour methanolic extracts of AC, PF and PA were 94.6 ± 7.4, 41.2 ± 4.2 and 9.1 ± 1.3 mg of gallic acid equivalents/ g of dry extract, respectively. AC showed the best total phenolic content and antioxidant capacity toward DPPH . PF showed the best antioxidant capacity to superoxide anion radical. Similar indexes of lipid peroxidation protection were observed with both AC and PF residues. Altogether, these data suggest that flour methanolic extracts of AC and PF residues may be useful as antioxidant supplements or food additives, notably the acerola (AC) extracts. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alternativas economicamente vantajosas com exploração completa do conteúdo antioxidante de resíduos de frutas tropicais de fábricas de sucos foram estudadas no estado de Alagoas, Brasil. Assim, extratos metanólicos de farinhas de resíduos de acerola (FRAC), maracujá (FRMA) e abacaxi (FRAB) foram avaliados quanto a sua capacidade antioxidante. Para isso, foram analisados o conteúdo total de fenóis, a capacidade antioxidante frente aos radicais DPPH e ânion radical superóxido e o efeito de proteção à peroxidação da membrana lipídica, causada pelo radical peroxila, dos extratos metanólicos das farinhas. No ultimo caso, um modelo de membrana bilamelar fosfolipídica com uma sonda fluorescente foi usado. Para a análise estatística, foi utilizado o programa epi info versão 6.04d (2001) e o Microsoft Excel, usando teste t, análise multivariada e qui-quadrado, considerando um p < 0,05 como significativo. Os resultados para o conteúdo total de fenóis dos extratos metanólicos das farinhas de resíduos de acerola (FRAC), maracujá (FRMA) e abacaxi (FRAB) foram 94,6 ± 7,4, 41,2 ± 4,2 e 9,1 ± 1,3 mg de equivalentes de ácido gálico/ g de extrato seco, respectivamente. FRAC mostrou o melhor conteúdo de fenóis e capacidade antioxidante frente ao radical DPPH . FRMA mostrou a melhor capacidade antioxidante frente ao ânion radical superóxido. Resposta similar foi observada entre FRAC e FRMA quanto à proteção frente a peroxidação da membrana lipídica. De modo geral, estes dados sugerem que extratos metanólicos de farinhas de FRAC e FRMA podem ser úteis como suplementos antioxidantes ou aditivos alimentares, em especial, o extrato de acerola.