CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Este trabalho descreve a investigaÃÃo quÃmica das espÃcies Calliandra sessilis e Calliandra mucungeana (Fabaceae). A ProspecÃÃo quÃmica dos extratos das raÃzes das respectivas espÃcies permitiu o isolamento e caracterizaÃÃo de esteroides, diterpenos e Ãsteres graxos. Do extrato hexÃnico foram isolados a mistura ternÃrias dos esteroides, β-sitosterol, espinasterol e estigmasterol, o triterpeno pentacÃclico lupeol, alÃm de um diterpeno de esqueleto cassano 2,12-dioxo-3-hidrÃxi-15,17-epÃxi-cassa-13(15),14(17)-dieno. Do extrato etanÃlico foram isolados uma mistura binÃria dos Ãsteres tetracosanodioato de bis-(2,3-diidroxipropila) e docosanodioato de bis-(2,3-diidroxipropila) e ainda, a mistura dos esteroides glicosilados, β-sitosterol, espinasterol e estigmasterol. Na determinaÃÃo estrutural dos compostos isolados, utilizou-se tÃcnicas espectomÃtricas como: infravermelho (IV), espectrometria de massas (EM-IES) e ressonÃncia magnÃtica nuclear de hidrogÃnio (RMN 1H) e carbono-13 (RMN 13C), incluindo tÃcnicas bidimensionais (COSY, HSQC e HMBC ) alÃm de comparaÃÃo com dados descritos na literatura / This work describes the chemical investigation of Calliandra sessilis and Calliandra mucungeana (Fabaceae). The Chemical prospection of the root extracts of the two species resulted in the isolation and characterization of steroids, diterpenes and fatty esters. From the hexane extract were isolated a ternary mixture of the steroids β-sitosterol, espinasterol and estigmasterol, the pentacyclic triterpene lupeol, besides a diterpene of skeleton cassane, 2,12-dioxo-3- hydroxy-15,17-epoxy-cassa-13(15),14(17)-diene. From the ethanol extract were isolated a binary mixture of bis-(2,3-dihydroxypropil) tetracosanodioate and bis-(2,3- dihydroxypropil) docosanodioate, as well as, a glucosidal steroidal mixture constituted of β-sitosterol, espinasterol and estigmasterol. The structural determinations of isolated compounds were performed by spectrometric techniques, such as: infrared (IR), mass spectrometry (IES-MS) and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) 13-carbon ( 13C NMR), including dimensional techniques (COSY, HSQC and HMBC), besides comparison with described data

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The economic importance of J. curcas is due to the high amount of oil accumulated in their seeds, specifically in the endosperm. In this context, the events related to the endosperm formation and the accumulation of toxic compounds in the seeds could help in the production of varieties that produce more oil and are less toxic. Thus, anatomical, proteomic and gene expression analysis were made with J. curcas seeds to contribute with the knowledge about physiologic events related with the formation of endosperm and the processes of synthesis and accumulation of phorbol esters. The anatomical analysis showed the maternal tissue responsible for the nutrients transfer to the endosperm and contributed to fill the gaps present in the literature about the anatomy of J. curcas seeds. The inner integument is the maternal tissue that presents the vasculature of the mother plant and is the responsible for the nutrition of the endosperm through the process of programmed cell death (PCD). Based on this result proteomic analysis of two anatomically different regions of the inner integument, named as proximal and distal, were performed. The identified proteins indicated that the inner integument pass through PCD in different degrees in the proximal and distal regions and that in this tissue there is a spatial distribution between catabolism and anabolism. In the proximal region especially hydrolases were identified and in the distal region storage proteins and proteins of biosynthetic pathways were prevalent. The gene expression analysis had two purposes: first, verify wether the transcripts levels of the genes likely involved in PCD, whose proteins were identified and quantified in the proteomic analysis, were related to the protein abundance and second, identify the site of synthesis of the committed enzyme in the phorbol esters biosynthesis, the casbene synthase, through a study with root, leaf, embryo, inner integument and endosperm and 14 putative genes of the mentioned enzyme. The results indicated that the proteins related to PCD must be controlled at transcript level. Nine putative genes from casbene synthase were expressed in roots and one of them was expressed in the leaf and embryo. This work denotes the role of PCD in the inner integument to the development of the seed and also demonstrates the transitory nature of storage of this tissue. In addition gives notation that the seed, despite of accumulates phorbol esters, do not synthesizes these compounds, but probably import them from roots. / A importÃncia econÃmica da espÃcie J. curcas deve-se a grande quantidade de Ãleo acumulada em suas sementes, especificamente no endosperma. Os eventos relacionados à formaÃÃo do endosperma e ao acÃmulo de compostos tÃxicos nas sementes podem auxiliar na produÃÃo de variedades com maior produÃÃo de Ãleo e menos tÃxicas. Visando isso, foram realizadas anÃlises anatÃmicas, proteÃmicas e de expressÃo de genes nas sementes de J. curcas para contribuir com o entendimento sobre os eventos fisiolÃgicos associados à formaÃÃo do endosperma e aos processos de sÃntese e acÃmulo dos Ãsteres de forbol. A anÃlise anatÃmica mostrou o tecido maternal responsÃvel pela transferÃncia de nutrientes para o endosperma e contribuiu para resolver lacunas existentes na literatura sobre a anatomia de sementes de J. curcas. O integumento interno à o tecido maternal que apresenta a vascularizaÃÃo da planta-mÃe e à o responsÃvel pela nutriÃÃo do endosperma atravÃs do processo de morte celular programada (PCD). Com base nesse resultado, realizou-se uma anÃlise proteÃmica do integumento interno na regiÃo proximal e distal ao endosperma, uma vez que as caracterÃsticas celulares indicativas de PCD nesse tecido se apresentavam diferentes nessas regiÃes. As proteÃnas identificadas indicaram que o integumento interno sofre PCD em diferentes graus nas diferentes regiÃes e que nesse tecido hà uma distribuiÃÃo espacial entre catabolismo e anabolismo, pois na regiÃo proximal identificaram-se principalmente hidrolases e na regiÃo distal proteÃnas de reserva e de vias biossintÃticas. A anÃlise de expressÃo de genes teve dois propÃsitos: primeiro, verificar se os nÃveis de transcritos de genes possivelmente relacionados à PCD, cujas proteÃnas foram identificadas e quantificadas na anÃlise proteÃmica, estavam relacionados à abundÃncia de proteÃnas e o segundo foi identificar o local de sÃntese da enzima comprometida na biossÃntese dos Ãsteres de forbol, a sintase do casbeno, atravÃs de um estudo com raiz, folha, embriÃo, integumento interno e endosperma e 14 genes candidatos à enzima mencionada. Os resultados indicaram que as proteÃnas relacionadas à PCD devem ser controladas no Ãmbito transcricional. Nove genes candidatos à sintase do casbeno foram expressos em raiz e um deles foi expresso na folha e no embriÃo. Este trabalho evidencia o papel da PCD no integumento interno para o desenvolvimento da semente, alÃm de demonstrar a natureza transitÃria de reserva desse tecido. Adicionalmente, dà indÃcios de que a semente, apesar de acumular Ãsteres de forbol, nÃo sintetiza esses compostos, mas possivelmente os importa das raÃzes.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Lipases (glycerol ester hydrolases, EC3.1.1.3) are versatile catalysts with broad and diverse possibilities of industrial applications. Its main application is essentially catalyze the hydrolysis of triglycerides. However, in micro-aqueous environments these enzymes have the ability to catalyze the reverse reaction of esterification. These enzymes do not require cofactors, have relatively low cost, are regioespecific, enantioselectives and may act on a broad range of temperature and pH. This work aimed to develop alternative technologies using enzymatic routes mediated by lipase from Rhizomucor miehei (RmL) immobilized on chitosan support in the presence of some classes of surfactants for the production of methyl butyrate and ethyl butyrate, two esters widely used in cosmetic and food industries. In this study two immobilization strategies were evaluated. In the first, the enzymes were immobilized in the presence of selected surfactants on chitosan supports previously activated with glutaraldehyde. In the second immobilization strategy, chitosan was crosslinked with glutaraldehyde after prior adsorption of the enzymes in the presence of surfactants. Among the immobilization procedures studied, the best results were achived when the enzyme was immobilized onto chitosan support in the presence of the surfactant sodium dodecyl sulphate SDS (0.23% m v-1) for 1 h at 4  C and 220 rpm, followed by crosslinking with 0.6% glutaraldehyde (v v-1) for 1 h at 25  C. In esterification experiments conducted with the best derivative, a detailed study of the parameters that affect the reaction rates were performed. The best yields were obtained when the reactions were conducted at 25  C, 6h and 150 rpm using n-heptane as a solvent. For methyl butyrate maximum esterification yield was 89% and for ethyl butyrate the maximum conversion observed was 92%. The results were comparable to yields observed when the esterification reactions were carried out with the commercial enzyme Lipozyme and the soluble enzyme under the same reaction conditions. / Lipases (glicerol Ãster hidrolases, E.C.3.1.1.3) sÃo catalisadores versÃteis com amplas e diversificadas possibilidades de aplicaÃÃo industrial. Sua principal aplicaÃÃo à essencialmente catalisar a hidrÃlise de triglicerÃdeos. Entretanto, em ambientes micro-aquosos estas enzimas possuem a habilidade de catalisar a reaÃÃo reversa de esterificaÃÃo. Estas enzimas nÃo requerem cofatores, possuem custo relativamente baixo, sÃo regioespecÃficas, enantiosseletivas, alÃm de atuarem em uma larga faixa de temperatura e pH. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologias alternativas utilizando rotas enzimÃticas mediadas por lipase de Rhizomucor miehei (RmL) imobilizada em suporte quitosana na presenÃa de algumas classes de surfactantes para a produÃÃo de butirato de metila e butirato de etila, dois Ãsteres amplamente utilizados na indÃstria de cosmÃticos e de alimentos. Neste estudo, duas estratÃgias de imobilizaÃÃo foram avaliadas. Na primeira, a enzima foi imobilizada na presenÃa dos surfactantes selecionados em suporte quitosana previamente reticulado com glutaraldeÃdo. Na segunda estratÃgia de imobilizaÃÃo, o suporte utilizado foi reticulado com glutaraldeÃdo apÃs prÃvia adsorÃÃo da enzima na presenÃa dos surfactantes. Dentre os procedimentos de imobilizaÃÃo estudados, os melhores resultados foram obtidos quando a enzima foi previamente adsorvida no suporte quitosana na presenÃa do surfactante dodecil sulfato de sÃdio (0,23% m.v-1) por 1h a 4ÂC e 220 rpm, seguido de reticulaÃÃo com glutaraldeÃdo 0,6% (v.v-1) por 1h a 25ÂC. Nos ensaios de esterificaÃÃo utilizando o melhor derivado obtido, foi efetuado um estudo detalhado dos parÃmetros que afetam as taxas de conversÃo. Os melhores rendimentos foram obtidos quando as reaÃÃes foram conduzidas a 25ÂC, 6h e 150 rpm utilizando n-heptano como solvente. Para o butirato de metila, o rendimento mÃximo de esterificaÃÃo foi de 89% e para o butirato de etila a maior conversÃo observada foi de 92%. Os resultados obtidos foram comparÃveis aos rendimentos de esterificaÃÃo observados quando foi utilizada a enzima comercial Lipozyme nas mesmas condiÃÃes reacionais.

nÃo hà / Os Ãsteres de Ãcidos graxos representam uma das mais importantes classes de compostos orgÃnicos devido à diversidade de aplicaÃÃes, tais como aromas, biopesticida, biodiesel e antimicrobianos. O setor industrial de Ãleos e gorduras, bem como as pesquisas cientÃficas, tem desenvolvido diversos processos para manipular a composiÃÃo das misturas de triglicerÃdeos para a sÃntese de Ãsteres a partir dos Ãcidos graxos, por rota quÃmica ou enzimÃtica. Nesse contexto, a lipase à a enzima mais amplamente utilizada por apresentar diversas vantagens relacionadas à sua especificidade. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a seletividade das lipases imobilizadas de Candida antarctica tipo B e de Rhizopus oryzae em relaÃÃo aos Ãcidos graxos saturados (AGS) e insaturados (AGI), bem como a conversÃo destes em Ãsteres etÃlicos. A seletividade foi avaliada em relaÃÃo ao Ãcido oleico (insaturado) e o Ãcido eicosanÃico (saturado), obtidos na hidrÃlise quÃmica do Ãleo do peixe tilÃpia (Oreochromis niloticus). Para anÃlise da seletividade foi realizado um planejamento experimental composto central 24, variando a velocidade de agitaÃÃo (rpm), temperatura (ÂC), razÃo molar (etanol:Ãcido graxo) e quantidade de enzima (%m), mantendo-se fixa a quantidade de peneira molecular â zeÃlita 5 à â (5 %m) e o tempo reacional (24 h). Da mesma forma, o comportamento das enzimas em relaÃÃo aos AGS foi avaliado segundo planejamento experimental composto central 23, variando temperatura (ÂC), razÃo molar (etanol:Ãcido graxo) e quantidade de enzima (%m), mantendo-se fixa a quantidade de peneira â zeÃlita 5 à â molecular (5 %m), agitaÃÃo (180 rpm) e tempo reacional (24 h), utilizando como substrato uma mistura de Ãcidos palmÃtico e esteÃrico. Em todas as anÃlises estatÃsticas foram considerados 85% de intervalo de confianÃa. Em relaÃÃo à esterificaÃÃo dos Ãcidos graxos do Ãleo de peixe hidrolisado, ambos os catalisadores foram seletivos para o Ãcido saturado eicosanÃico. Quase todas as variÃveis estudadas influenciaram na seletividade da lipase de R. oryzae, enquanto quase nenhuma foi significativa para a seletividade da lipase de C. antarctica. Quando a resposta estudada foi a conversÃo, a lipase de C. antarctica foi responsÃvel pelas maiores conversÃes de Ãcido oleico em oleato de etila. Quando os ensaios foram realizados utilizando lipase de R. oryzae, mais variÃveis significativas foram encontradas para o modelo de conversÃo. No meio reacional contendo a mistura de AGS, ambas as lipases apresentaram maior afinidade pelo Ãcido palmÃtico. A faixa de valores selecionada para avaliar a influÃncia na seletividade nÃo afetou significativamente a resposta da lipase de C. antarctica, mas foram todas significativas para a de R. oryzae. Quanto à conversÃo, a lipase de C. antarctica foi responsÃvel pelas maiores conversÃes de Ãcidos esteÃrico e praticamente todas as variÃveis selecionadas foram significativas para o modelo da conversÃo quando ambas as enzimas foram utilizadas. / Esters of fatty acids represent one of the most important classes of organic compounds due to ther variety of applications, such as flavoring, biopesticide, biodiesel and antimicrobials. Oils and fats industry as well as scientific researches have developed many different processes to manipulate composition of triglycerides mixtures. The aim is synthesis of esters from fatty acids by chemical or enzymatic routes. In this context, lipase is the most widely used enzyme due to several advantages related its specificity. The aim of this study was to evaluate the selectivity of immobilized lipases of Candida antarctica type B and Rhizopus oryzae compared to saturated (SFA) and unsaturated (UFA) fatty acids as well as their yield into ethyl esters. Selectivity was assessed with respect to oleic acid (unsaturated) and eicosanoic acid (saturated), obtained from chemical hydrolysis of fish oil Tilapia (Oreochromis niloticus), through 24 central composite design using agitation rate (rpm), temperature (ÂC), molar ratio (ethanol:fatty acid) and amount of enzyme (%wt) as independ variables (design factors). The amount of molecular sieve â zeolite 5 à â (5 %wt) and reaction time (24 h) were fixed. Likewise, the behavior of both enzymes to the SFA was evaluated according to 23 central composite design where temperature (ÂC), molar ratio (ethanol:fatty acid) and amount of enzyme (%wt) were independ variables. The amount of molecular sieve â zeolite 5 à â (5 %wt), stirring (180 rpm) and reaction time (24 h) were fixed and a mixture of palmitic and stearic acids was used as substrate. A confidence interval of 85% was considered for all statistical analyses. Regarding the esterification of fatty acids from hydrolyzed fish oil, both catalysts were selective for saturated eicosanoic acid rather than for the unsaturated acid. The design factors did not present significant effect on response variable when lipase from C. antarctica was used like catalyst. However all design factors presented an influence on the selectivity when lipase from R. oryzae was used like catalyst. In this way, lipase of C. antarctica lead to higher conversions of oleic acid into ethyl oleate and more significant variables have been found for the model when lipase of R. oryzae was uesd in assays. In the reaction medium containing the mixture of SFA, both lipases showed higher affinity for palmitic acid. The values range selected to evaluate the selectivity did not present significant effect on responses when lipase from C. antarctica was used, however that value range was significant for all assays performed using lipase from R. oryzae. The higher stearic acid conversions were obtained when lipase from C. antarctica was used like catalyst and all design factors were significant for both enzymes.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Jatropha curcas L. is a plant native to America and belongs to the Euphorbiaceae family. Currently it is gaining economical interest mainly because it is an oilseed crop with potential to produce biodiesel. However, presence of phorbol esters (a class of diterpenes) that are the major toxic constituents of the seeds, limits a better usage of the plant, by making the use of the residue, obtained after the oil extraction from the seeds, unfeasible for animal feed, due to its pro-carcinogenic activity and inflammatory action. Proteomic analysis of the plastids isolated from developing seeds of Jatropha is important because the synthesis of fatty acid as well as phorbol esters, the two most attractive compounds in the study of Jatropha curcas, occur in plastids. Proteomic analysis of this organelle is crucial to better understand and explore not only the biosynthetic pathway of these two compounds but other metabolic pathways , and addtionaly providing foundation for researchs that aimed to develope genotypes with more suitable characteristics for industrial applications. In this study, we performed a proteomic analysis of plastids isolated from the endosperm of developing Jatropha curcas seeds that were in the initial stage of deposition of protein and lipid reserves. Proteins extracted from the plastids were digested with trypsin, and the peptides were applied to an EASY-nano LC system coupled online to an ESI-LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer, and this led to the identification of 1103 proteins representing 804 protein groups, of which 923 were considered as true identifications, and this considerably expands the repertoire of J. curcas proteins identified so far. Of the identified proteins, only five are encoded in the plastid genome, and none of them are involved in photosynthesis, evidentiating the nonphotosynthetic nature of the isolated plastids. Homologues for 824 out of 923 identified proteins were present in three different plastids proteins databases i.e. PPDB, SUBA and PlProt, while homologues for 13 proteins were not found in any of these three databases but were marked as plastidial by at least one of the three prediction programs used (TargetP, ChloroP and PlantMPloc). Functional classification showed that proteins belonging to amino acids metabolism comprise the main functional class, followed by carbohydrate, energy, and lipid metabolisms. The small and large subunits of Rubisco were identified, and their presence in plastids is considered to be an adaptive feature counterbalancing for the loss of one-third of the carbon as CO2 as a result of the conversion of carbohydrate to oil through glycolysis. While several enzymes involved in the biosynthesis of several precursors of diterpenoids were identified, we were unable to identify any terpene synthase/cyclase, which suggests that the plastids isolated from the endosperm of developing seeds do not synthesize phorbol esters. In conclusion, this study provides insights into the major biosynthetic pathways and certain unique features of the plastids from the endosperm of developing seeds at the whole proteome level. / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L.) à uma planta nativa da AmÃrica, pertencente à famÃlia Euphorbiaceae. Atualmente, ela desperta interesse econÃmico principalmente por se tratar de uma oleaginosa com potencial para a produÃÃo de biodiesel. Entretanto, a presenÃa de Ãsteres de forbol (uma classe de diterpeno), que sÃo os principais constituintes tÃxicos das sementes, limita uma melhor utilizaÃÃo dessa planta, por inviabilizar o uso do resÃduo de extraÃÃo do Ãleo das sementes na alimentaÃÃo animal, bem como, por apresentar atividade prÃ-carcinogÃnica e aÃÃo inflamatÃria. A anÃlise proteÃmica de plastÃdeos, isolados de sementes em desenvolvimento de pinhÃo manso, à uma importante vertente de estudo, pois tanto a sÃntese de Ãcidos graxos como dos Ãsteres de forbol, os dois compostos mais atrativos no estudo de Jatropha curcas, ocorrem nos plastÃdeos. O estudo proteÃmico dessa organela torna-se crucial para melhor compreender e explorar nÃo somente as vias biossintÃticas desses dois compostos, como de outras vias metabÃlicas, alÃm de proporcionar um conjunto de dados que pode ser utilizado em pesquisas voltadas para o desenvolvimento de genÃtipos com caracterÃsticas mais adequadas para aplicaÃÃes industriais. No presente trabalho, realizou-se uma anÃlise proteÃmica de plastÃdeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhÃo manso, que estavam nos estÃgios iniciais de deposiÃÃo de lipÃdios e proteÃnas de reserva (25-30DAA), confirmados por meio de anÃlises histolÃgica e histoquÃmica. As proteÃnas extraÃdas dos plastÃdeos foram digeridas com tripsina e os peptÃdeos foram aplicados no sistema de nano-LC EASYII acoplado online ao espectrÃmetro de massa nano ESI LTQ-Orbitrap velos, o que resultou na identificaÃÃo 1103 proteÃnas, representando 804 grupos de proteÃnas, dos quais 923 foram consideradas identificaÃÃes verdadeiras. Isso expandiu consideravelmente o repertÃrio de proteÃnas do pinhÃo manso atà agora identificas. Dentre as proteÃnas identificadas, apenas 5 sÃo codificadas pelo genoma plastidial, e nenhuma delas està envolvida na fotossÃntese, o que evidencia a natureza nÃo fotossintÃtica dos plastÃdeos isolados. HomÃlogos de 824, dentre as 923 proteÃnas identificadas, estavam presentes nos bancos de dados PPDB, SUBA e PlProt, enquanto homÃlogos para 13 proteÃnas nÃo foram encontrados em nenhum dos trÃs bancos de dados plastidiais, mas foram detectados como plastidiais por pelo menos um dos trÃs programas de prediÃÃo de localizaÃÃo subcelular utilizados (TargetP, ChloroP, PlantMPloc). A classificaÃÃo funcional mostrou que a maioria das proteÃnas identificadas pertencia ao metabolismo dos aminoÃcidos, seguido dos metabolismos dos carboidratos, energÃtico e dos lipÃdios. As subunidades maiores e menores da Rubisco foram identificadas, e sua presenÃa nos plastÃdeos foi considerada uma caracterÃstica adaptativa para contrabalancear a perda de um terÃo do carbono na forma de CO2 como um resultado da conversÃo de carboidratos em Ãleo atravÃs da glicÃlise. Apesar de enzimas envolvidas na biossÃntese de diversos precursores dos diterpenÃides terem sido identificadas, nÃo foi detectado nenhuma terpeno sintase/ciclase, o que sugere que os plastÃdeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento nÃo sintetizam Ãsteres de forbol, apesar de uma grande quantidade desse composto ser encontrada neste tecido. Como conclusÃo, o presente trabalho proporciona insights sobre as principais vias biossÃntÃticas, e sobre caracterÃsticas peculiares dos plastideos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento.