VILNIAUS UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS MIKROBIOLOGIJPOS IR BIOTECHNOLOGIJOS KATEDRA Sandra Armalytė Ląstelių žymens p16ink4A raiškos tyrimai kiekybinės PGR metodu Santrauka Ankstyvai gimdos kaklelio vėžio diagnostikai šiuo metu plačiausiai taikomas citologinis tyrimas (PAP testas). PAP testo jautrumas ir specifiškumas ankstyvojoje gimdos kaklelio vėžio diagnostikoje yra gana žemas. Diagnozuojant priešvėžinius ar vėžinius pakitimus, gaunama 15-50% klaidingai neigiamų rezultatų ir iki 30% klaidingai teigiamų rezultatų. Todėl yra aktualu sukurti naujus metodus, kurie leistų citologiniame mėginyje tiksliau identifikuoti dėl ŽPV infekcijos transformuotas, pakitusias ląsteles. Dėl šių priežasčių šiuo metu nemažas dėmesys skiriamas ląstelių žymens p16INK4A nustatymui. Ląstelių žymuo p16INK4A yra specifiškai indukuojamas, įvykus ŽPV sukeltai ląstelių onkogeninei transformacijai. Taigi, šis žymuo gali padėti aptikti mažus priešvėžinių ar vėžinių pokyčių židinius. Tačiau reikalingi tolesni išsamūs tyrimai, patvirtinantys šio žymens diagnostinę vertę. Šio tyrimo tikslas, naudojant atvirkštinės transkripcijos kiekybinės PGR metodą, ištirti ląstelių žymens p16ink4A RNR raišką, esant intraepiteliniams gimdos kaklelio ląstelių pakitimams arba gimdos kaklelio vėžiui ir įvertinti šio žymens sąsajas su priešvėžinių ar vėžinių pokyčių išsivystymo laipsniu. Šiame darbe šis žymuo buvo tiriamas RNR lygmenyje ir nustatyta jo diagnostinė vertė. Naudojant kiekybinį atvirkštinės... [toliau žr. visą tekstą] / VILNIUS UNIVERSITY FACULTY OF NATURAL SCIENCES DEPARTAMENT OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY Sandra Armalytė Studies on the expression of cellular marker p16INK4A by quantitative PCR Summary For the diagnostics of cervical cancer cytological test (Pap smear) is commonly used. The Papanicolaou (Pap) test is a cytological staining technique, which allows the identification of asymptomatic women who have preneoplastic lesions or early cancer of the uterine cervix. The success of the Pap smear test is limited with respect to sensitivity and specificity. False negative rates for cervical premalignant lesions and cervical cancer lie between 15% and 50% and false positive rates of approximately 30% have been reported. The failure of the Pap test to eradicate this potentially preventable disease outlines the limitations of current screening programmes and emphasises the need for the identification of specific biomarkers for dysplastic epithelial cells of the cervix to aid in primary screening and lesion diagnosis. Therefore, attempts are made to detect the cellular marker p16INK4A. Protein p16INK4A, an indirect marker of cell cycle dysregulation, is commonly expressed in cervical dysplasias and carcinomas. This biomarker can help to diagnose cervical premalignant lesions or cervical cancer. More experiments are needed to confirm the diagnostic value of this marker. The aim of the current study was to investigate the expression of p16INK4A RNA by quantitative reverse transcriptase PCR... [to full text]

Darbo tikslas. Išsiaiškinti gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksnių paplitimą tarp 30 - 60 m. amžiaus moterų ir nustatyti jų sąsajas su gimdos kaklelio vėžiu, bei pateikti rekomendacijas gimdos kaklelio vėžio profilaktikai. Metodika. Gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniams išaiškinti atliktas atvejo – kontrolės anketinis tyrimas. Tyrime dalyvavo 317 moterų: 105 sergančios gimdos kaklelio vėžiu, gydytos KMUK ginekologijos skyriuje ir 212 nesergančių gimdos kaklelio vėžiu moterų KMUK akių skyriuje (santykis 1:2). Duomenys apie rizikos veiksnius (hormoninių kontraceptinių priemonių vartojimas, rūkymas, lytinio elgesio ypatybės ir kt.) buvo renkami panaudojus klausimyną. Rezultatai. Moterims nuo 40 iki 50 metų nustatyta 3,83 karto didesnė gimdos kaklelio vėžio rizika palyginti su moterimis, kurių amžius iki 40 metų (ŠS = 3,83; PI 95% [0,122-0,558]; p = 0,002). Moterys nuo 51 iki 60 metų turi 2,43 karto didesnę gimdos kaklelio vėžio riziką palyginti su moterimis, kurių amžius iki 40 metų (ŠS = 2,43; PI 95% [1,26-4,67]; p = 0,007). Moterys, kurios gimdė 3 ir daugiau kartų pasižymi 1,84 karto didesne rizika susirgti gimdos kaklelio vėžiu palyginti su 1 kartą gimdžiusiomis moterimis (ŠS = 1,84; PI 95% [0,82-4,10]; p = 0,135). Moterims su spec. viduriniu, nebaigtu viduriniu bei pradiniu išsilavinimu 2 kartus padidėjusi gimdos kaklelio vėžio rizika palyginti su moterimis turinčiomis aukštąjį išsilavinimą (ŠS = 2,00; PI 95% [0,91-4,40]; p = 0,083). Gimdos... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this work. To investigate the cervical cancer risk factor prevalence between 30 and 60 years women and to determine their correlation with cervical cancer, and to recommend measures for cervical cancer prevention. Methodology. A case - control study was conducted in order to investigate risk factors for cervical cancer. Study included 317 women: 105 in case of cervical cancer from Kaunas Medical University Clinics - Gynecology section and control group of 212 patients of Kaunas Medical University Clinics - Ophthalmology section (ratio 1:2). Data on risk factors (hormonal contraceptive use, smoking, sexual behavior and other characteristics) were collected using a questionnaire. Results. Women from 40 to 50 years had 3,83 times greater risk for cervical cancer when compared to women aged up to 40 years, (OR = 3,83; CI 95% [0,122-0,558]; p = 0,002). Women from 51 to 60 years have 2,43 times greater risk for cervical cancer compared to women aged under 40 years (OR = 2,43; CI 95% [1,26-4,67]; p = 0,007). Multiparous women who had 3 or more deliveries have 1,84 times greater risk for cervical cancer compared with uniparous women (OR = 1,84; CI 95% [0,82-4,10]; p = 0,135). Women with the higher, incomplete secondary and primary education have 2 times increase in the risk of cervical cancer compared with women with higher education (OR = 2,00; CI 95% [0,91-4,40]; p = 0,083). Cervical cancer risk for women with disabilities is increased 3 times... [to full text]

Gimdos kaklelio vėžys pasaulyje yra antroji, o Lietuvoje ketvirtoji pagal dažnumą moterų onkologinė liga. Pagrindinė gimdos kaklelio vėžio priežastis yra žmogaus papilomos viruso (ŽPV) infekcija gimdos kaklelyje. Vakarų šalyse ikivėžiniams pokyčiams ar vėžinėms ląstelės nustatyti yra naudojamas citologija paremtas Papanicolaou testas (Pap) ir ŽPV DNR testas. Šiuo metu naudojami ŽPV diagnostiniai testai remiasi molekulinės biologijos tyrimo metodais. Tyrimui buvo pasirinktas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas, o ne plačiai naudojamas JAV bei Europos kokybės sertifikatus turintis Hybrid Capture 2 (HC2) metodas. PGR yra ypač jautrus, greitas, komerciškai prieinamas metodas, kuriam reikalingas nedidelis tiriamosios medžiagos kiekis, ir kuriuo galima tiksliai identifikuoti ŽPV tipus. HC2 metodas nenustato ŽPV genotipų, galimi klaidingai neigiami rezultatai, nes nėra vidinės kontrolės, o dėl kryžminių reakcijų galimi klaidingai teigiami rezultatai. Naujausi literatūros šaltiniai teigia, kad PGR turi daug perspektyvų ateityje ir manoma, kad ŽPV nustatymo standartas bus 14 DR-ŽPV tyrimas sujungtas su ŽPV-16 ir ŽPV-18 tipų nustatymu. Todėl siekiant ŽPV tyrimams pasirinkti optimaliausią iš Lietuvoje siūlomų komercinių rinkinių Valstybiniame patologijos centre buvo atliekamas šis tyrimas. Įvertinus tyrimų rezultatus, tolesniems tyrimams pasirinktas „Seeplex® HPV4A ACE Screening“ ŽPV nustatymo rinkinys. / Cervical cancer is the second oncological disease in women in the world, and the fourth one in Lithuania. The main cause of the cervical cancer is Human papillomavirus (HPV) infection in the cervix uteri. In order to detect precancerous changes or cancer cells, a Papanicolaou (Pap) test based on cytology and HPV DNA test are used in the Western world. Currently used HPV diagnostic tests are based on molecular biology testing methods. The polymerase chain reaction (PCR) method, not the extensively used Hybrid Capture 2 (HC2) method awarded the certificate of quality by both the USA and Europe, was chosen. PCR is a particularly sensitive, fast, and commercially available method that needs a small quantity of research material and can identify the types of HPV. HC2 method does not detect HPV genotypes, false-negative results are possible because there is no internal control, and due to cross reactions, false-positive results are possible. The newest written sources state that PCR will have much potential in the future and it is thought that HPV detection standard will become 14 HR-HPV test combined with the detection of the types of HPV-16 and HPV-18. Therefore, in order to chose the optimum one for HPV tests from the commercial kits offered in Lithuania, this investigation was carried out in the National Centre of Pathology. Four different HPV diagnostic kits were used for the research. Having evaluated the research results, „Seeplex® HPV4A ACE Screening“ HPV diagnostic kit was... [to full text]

Šiame darbe tirta ŽPV infekcijos įtaką nėščiosios organizmo antioksidacinės sistemos būklei bei vertintas vietinio imuniteto atsakas į šią infekciją. Nustatytas tiriamųjų infekuotumas ŽPV; identifikuoti atskirų tipų ŽPV; palygintas tiriamųjų infekuotumas ŽPV tarp pirmojo ir trečiojo nėštumo trimestrų; ištirta antioksidacinės sistemos būklė bei vietinį imunitetą rodančių interleukinų (IL-10 ir IL-12) koncentracijų pokyčiai nėštumo metu priklausomai nuo ŽPV infekcijos. Atsižvelgiant į tai, kad Lietuvoje yra didelis sergamumas gimdos kaklelio vėžiu bei mirtingumas nuo jo, mūsų nustatytas nėščiųjų infekuotumas ŽPV bei identifikuoti ŽPV tipai leido įvertinti infekuotumo ŽPV pokyčius nėštumo metu didelės gimdos kaklelio vėžio rizikos populiacijoje ir sudarė galimybę palyginti gautus duomenis su kitų šalių autorių gautais duomenimis. Įrodyta, kad nėštumo metu moterims vystosi oksidacinis stresas, kurio lygis nepriklauso nuo infekuotumo ŽPV. Nustatyta, kad IL-10 ir IL-12 koncentracijos pokyčiai gimdos kaklelio nuoplovose (vietinis imunitetas) susiję su Th1 ir Th2 limfocitų funkcija ir priklauso nuo infekuotumo ŽPV. / This study analyses the impact of HPV infection for antioxidative state of pregnant woman, and the response of local immunity to this infection. In order to achieve this aim the following goals were: to determine HPV infection in pregnant women; to determine it’s types; to compare infection between first and third trimesters of pregnancy; to study the antioxidative system state during pregnancy due to HPV infection; to study interleukins (IL-10 and IL-12), which show local immunity, concentration changes during pregnancy due to HPV infection. Considering a high morbidity and mortality from cervical cancer in Lithuania, our established HPV infection in pregnant women and identified types of this virus enabled us to determine changed of HPV infection during pregnancy in high risk cervical cancer population. Also there is possibility to compare obtained data with that from authors in other countries. It is established, that women develop oxidative stress during pregnancy, and that its level did not depend on HPV infection. Changes of IL-10 and IL-12 concentrations in cervicovaginal washing fluid (local immunity) are related to Th1 and Th2 lymphocytes function, and depend on HPV infection.

Šiame darbe tirta ŽPV infekcijos įtaką nėščiosios organizmo antioksidacinės sistemos būklei bei vertintas vietinio imuniteto atsakas į šią infekciją. Nustatytas tiriamųjų infekuotumas ŽPV; identifikuoti atskirų tipų ŽPV; palygintas tiriamųjų infekuotumas ŽPV tarp pirmojo ir trečiojo nėštumo trimestrų; ištirta antioksidacinės sistemos būklė bei vietinį imunitetą rodančių interleukinų (IL-10 ir IL-12) koncentracijų pokyčiai nėštumo metu priklausomai nuo ŽPV infekcijos. Atsižvelgiant į tai, kad Lietuvoje yra didelis sergamumas gimdos kaklelio vėžiu bei mirtingumas nuo jo, mūsų nustatytas nėščiųjų infekuotumas ŽPV bei identifikuoti ŽPV tipai leido įvertinti infekuotumo ŽPV pokyčius nėštumo metu didelės gimdos kaklelio vėžio rizikos populiacijoje ir sudarė galimybę palyginti gautus duomenis su kitų šalių autorių gautais duomenimis. Įrodyta, kad nėštumo metu moterims vystosi oksidacinis stresas, kurio lygis nepriklauso nuo infekuotumo ŽPV. Nustatyta, kad IL-10 ir IL-12 koncentracijos pokyčiai gimdos kaklelio nuoplovose (vietinis imunitetas) susiję su Th1 ir Th2 limfocitų funkcija ir priklauso nuo infekuotumo ŽPV. / This study analyses the impact of HPV infection for antioxidative state of pregnant woman, and the response of local immunity to this infection. In order to achieve this aim the following goals were: to determine HPV infection in pregnant women; to determine it’s types; to compare infection between first and third trimesters of pregnancy; to study the antioxidative system state during pregnancy due to HPV infection; to study interleukins (IL-10 and IL-12), which show local immunity, concentration changes during pregnancy due to HPV infection. Considering a high morbidity and mortality from cervical cancer in Lithuania, our established HPV infection in pregnant women and identified types of this virus enabled us to determine changed of HPV infection during pregnancy in high risk cervical cancer population. Also there is possibility to compare obtained data with that from authors in other countries. It is established, that women develop oxidative stress during pregnancy, and that its level did not depend on HPV infection. Changes of IL-10 and IL-12 concentrations in cervicovaginal washing fluid (local immunity) are related to Th1 and Th2 lymphocytes function, and depend on HPV infection.

This dissertation observes the association between human papillomavirus (HPV) integration into the host cell genome and cervical intraepithelial lesions. The aim of this study is to determine how the grade of HPV16 DNA integration into the host cell genome (HPV E2 gene deletion) is related to cervical intraepithelial lesions. 253 women were screened for HPV infection and the majority was diagnosed with HPV type 16. The most frequently determined was HPV grade II integration. No statistically significant difference was defined while analyzing the relations between the status of HPV E2 gene integration and the grade of cervical intraepithelial lesions. The fact that integration of HPV type 16 was determined in low grade cervical squamous intraepithelial lesions or in cases with no intraepithelial lesions shows that virus integration occurs at the early stage of carcinogenesis. It is noteworthy that during the follow-up (secondary visit after 6 month) 50% of HPV positive women were identified with mRNR expression which probably establishes the presence of persistent active HPV infection. The research provided is highly significant for improvement of cervical cancer screening programms. Adjusting Pap smear, HPV DNA detection and determination of other HPV biomarkers (such as E2 gene deletion mRNR), it becomes possible to separate out HPV positive women with no clinical signs, although, belonging to the of high risk group for cervical carcinoma developing. / Disertacijoje nagrinėjama sąsaja tarp žmogaus papilomos viruso (ŽPV) integracijos į gimdos kaklelio epitelio ląstelių genomą ir intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių. Pagrindinis darbo tikslas – nustatyti, kaip 16 tipo ŽPV DNR integracijos laipsnis (ŽPV E2 geno iškrita) susijęs su intraepiteliniais gimdos kaklelio pokyčiais. Ištyrus 253 moteris nustatyta, kad dauguma moterų buvo infekuotos 16 tipo ŽPV. Dažniausiai nustatyta II laipsnio šio tipo ŽPV integracija. Statistiškai reikšmingo skirtumo analizuojant sąsajas tarp ŽPV E2 geno integracijos pobūdžio ir intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių laipsnio nenustatyta. Tai, kad integruotų 16 tipo ŽPV formų nustatyta esant nežymių arba net nesant intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių, rodo, jog viruso integracija yra ankstyvasis kancerogenezės įvykis. Pažymėtina, kad pakartotinio patikrinimo metu 50 proc. ŽPV infekuotų moterų konstatuota mRNR raiška, kas rodo besitęsiančią aktyvią ŽPV infekciją. Atliktas tyrimas yra svarbus gerinant patikros dėl gimdos kaklelio patologijos programas: derinant Pap testą ir ŽPV DNR bei kitų ŽPV žymenų nustatymą (mRNR, E2 geno iškrita) galima atrinkti infekuotas ŽPV moteris, kurioms dar nėra klinikinių požymių, tačiau jos priklauso didelės rizikos susirgti gimdos kaklelio vėžiu grupei.

Disertacijoje nagrinėjama sąsaja tarp žmogaus papilomos viruso (ŽPV) integracijos į gimdos kaklelio epitelio ląstelių genomą ir intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių. Pagrindinis darbo tikslas – nustatyti, kaip 16 tipo ŽPV DNR integracijos laipsnis (ŽPV E2 geno iškrita) susijęs su intraepiteliniais gimdos kaklelio pokyčiais. Ištyrus 253 moteris nustatyta, kad dauguma moterų buvo infekuotos 16 tipo ŽPV. Dažniausiai nustatyta II laipsnio šio tipo ŽPV integracija. Statistiškai reikšmingo skirtumo analizuojant sąsajas tarp ŽPV E2 geno integracijos pobūdžio ir intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių laipsnio nenustatyta. Tai, kad integruotų 16 tipo ŽPV formų nustatyta esant nežymių arba net nesant intraepitelinių gimdos kaklelio pokyčių, rodo, jog viruso integracija yra ankstyvasis kancerogenezės įvykis. Pažymėtina, kad pakartotinio patikrinimo metu 50 proc. ŽPV infekuotų moterų konstatuota mRNR raiška, kas rodo besitęsiančią aktyvią ŽPV infekciją. Atliktas tyrimas yra svarbus gerinant patikros dėl gimdos kaklelio patologijos programas: derinant Pap testą ir ŽPV DNR bei kitų ŽPV žymenų nustatymą (mRNR, E2 geno iškrita) galima atrinkti infekuotas ŽPV moteris, kurioms dar nėra klinikinių požymių, tačiau jos priklauso didelės rizikos susirgti gimdos kaklelio vėžiu grupei. / This dissertation observes the association between human papillomavirus (HPV) integration into the host cell genome and cervical intraepithelial lesions. The aim of this study is to determine how the grade of HPV16 DNA integration into the host cell genome (HPV E2 gene deletion) is related to cervical intraepithelial lesions. 253 women were screened for HPV infection and the majority was diagnosed with HPV type 16. The most frequently determined was HPV grade II integration. No statistically significant difference was defined while analyzing the relations between the status of HPV E2 gene integration and the grade of cervical intraepithelial lesions. The fact that integration of HPV type 16 was determined in low grade cervical squamous intraepithelial lesions or in cases with no intraepithelial lesions shows that virus integration occurs at the early stage of carcinogenesis. It is noteworthy that during the follow-up (secondary visit after 6 month) 50% of HPV positive women were identified with mRNR expression which probably establishes the presence of persistent active HPV infection. The research provided is highly significant for improvement of cervical cancer screening programms. Adjusting Pap smear, HPV DNA detection and determination of other HPV biomarkers (such as E2 gene deletion mRNR), it becomes possible to separate out HPV positive women with no clinical signs, although, belonging to the of high risk group for cervical carcinoma developing.